大鼠淚腺上皮細胞的原代培養和鑒定

曾 嬙 李新萍 李利民

干眼病是一種由多種因素引起的淚液分泌減少或蒸發過快導致的眼表疾病。雖然干眼病不致命，但嚴重影響到患者生活質量[1, 2]。由于生活方式改變，例如長期處于空調調控的干燥環境中、長期閱讀書籍或使用電子產品導致的過度用眼，使干眼病發生率逐年升高，全球范圍內的干眼病發生率達6%～34%[3～5]。在美國成年人群中干眼病患者約占9.3%，年齡超過50歲人群的發生率約11.3%，女性發生率高達22.8%[6]。在我國干眼病發生率為31.4%，尤其在年長女性中和高緯度地區發生率更高[7]。

淚腺細胞是淚腺中的主要功能細胞，具有分泌水、電解質和蛋白的作用，這些分泌物形成淚液膜的親水層，保持眼睛濕潤并維持眼部健康[8]。淚腺組織內炎性細胞的浸潤，產生大量的炎性細胞因子，導致淚腺上皮細胞死亡，從而導致淚液分泌減少，這是引起干眼病的重要原因之一[9～11]。分離和培養淚腺上皮細胞, 是研究淚腺功能的基礎, 也是研究干眼病發病機制和開發治療藥物的重要手段之一。本研究建立了從大鼠淚腺分離培養淚腺上皮細胞的方法，為干眼病的研究提供了一種穩定經濟的細胞模型。

材料與方法

1.主要試劑：DMEM培養基、FBS、牛垂體提取物、重組表皮生長因子、角化細胞無血清培養基、青霉素-鏈霉素雙抗、PBS、鼠尾膠原、防熒光淬滅劑均購自美國Life Technologies公司。Hoechst 33342和霍亂毒素(cholera toxin，CT)購自美國Sigma-Aldrich公司。膠原蛋白酶購自瑞士Roche公司。透明質酸酶購自美國Worthington公司。DNA酶購自德國EMD Millipore公司。細胞角蛋白(cytokeratin,CK, ab86734)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad, ab76055)、波形蛋白(vimentin, Vim, ab8978)、S100(ab76729)和α-平滑肌蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA, ab5694)等一抗，以及Alexa Fluor 488 結合的羊抗鼠二抗(ab150113)、Alexa Fluor 488 結合的羊抗兔二抗(ab150077)均購自英國Abcam公司。

2.淚腺上皮細胞的分離培養：分離培養方法根據文獻[12,13]改良建立。采用4周齡Sprague-Dawley大鼠(體質量150～180g)，從中分離純化淚腺上皮細胞。大鼠經麻醉處死后，手術摘除其淚腺。淚腺組織經PBS洗滌，去除殘留血漬，小心剝離周邊的結締組織，剪碎，加入0.5mg/ml膠原蛋白酶、100units/ml透明質酸酶和14080units/ml DNA酶，在90mm培養皿中37℃條件下消化2h，每20min輕輕振動一次。收集細胞懸液，70μm濾器過濾去除未消化組織，在1500r/min條件下離心3min，收集下層細胞。加入DMEM/F12培養液混懸細胞，細胞懸液經培養液洗滌兩次后，接種于75cm2的培養瓶中，放入CO2培養箱培養2h后，棄去已貼壁細胞(主要是纖維細胞)。小心吸取未貼壁細胞懸液(主要是腺細胞)，轉入膠原(5μg/cm2)預包被的培養瓶中，加入添加了10% FBS、50μg/ml BPE、5ng/ml rEGF、80ng/ml CT、1%雙抗的KSFM培養基中，靜置培養24h，換新鮮培養基。培養20天左右的細胞可傳代培養。

3.淚腺上皮細胞的鑒定：采用細胞免疫熒光染色方法對培養的淚腺上皮細胞主要標志物進行鑒定。淚腺細胞接種于適用于免疫熒光實驗的8孔腔室載玻片，培養箱里過夜培養，抽去多余培養液后，用4%多聚甲醛固定10min。然后用PBS輕輕漂洗2min，更換為0.25%Triton X-100溶液，培養15min使細胞穿孔暴露胞內蛋白。用PBS輕輕漂洗后，加入2% BSA溶液封閉1h，再加入一抗在4℃條件下濕盒中孵育過夜。一抗包括anti-CK (1∶100), anti- E-cad (1∶100), anti-Vim (1∶200), anti-S100 (1∶400) 和anti-α-SMA (1∶400)。去掉多余的抗體液，經PBS洗滌后，加入相應的Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠二抗(1∶200)或羊抗兔二抗(1∶200)孵育1h。PBS洗去多余二抗后，加入Hoechst 33342(1∶250)染核。拆去孔室裝置，用防熒光淬滅劑封閉玻片，指甲油封固。激光共聚焦顯微鏡(FV1000，日本Olympus公司)下觀察結果。

結 果

1.細胞形態和生長觀察：分離的淚腺細胞包括多種細胞，即酶消化后的上皮細胞、肌上皮細胞、間充質細胞和少量紅細胞。紅細胞由于具有懸浮生長的特征，可以通過更換新鮮培養基來消除。成纖維細胞沉降并在2h內黏附到培養瓶底部，因此，可利用成纖維細胞這個特性在其黏附2h后，將漂浮細胞轉移到另一個膠原包被的培養瓶中以去除成纖維細胞。原代培養的淚腺上皮細胞在3天內貼附到瓶底上，并增殖形成匯合的單層細胞。淚腺上皮細胞表現出鵝卵石形態，并混有少量梭形細胞(圖1)。21天后，細胞長滿瓶底的80%～90%，將細胞傳代，傳代后的細胞多數表現出鵝卵石形態和長條形，也有極少數平鋪展開的大尺寸細胞(圖2中A、B)。

圖1 原代培養大鼠淚腺細胞的形態 A、D.第7天；B、E.第14天；C、F.第21天

圖2 傳代大鼠淚腺細胞的形態(×100)

2.細胞免疫熒光染色鑒定：通過免疫熒光染色標記不同的細胞標志物對分離培養的細胞進行鑒定。細胞角蛋白和E-鈣黏蛋白是上皮細胞標志物，波形蛋白是間充質細胞標志蛋白，而α-SMA和S100蛋白在肌上皮細胞中大量表達，是肌上皮細胞標志蛋白。分離培養的細胞高表達細胞角蛋白和E-鈣黏蛋白，弱表達α-SMA和S100蛋白，基本不表達波形蛋白，表明從淚腺組織分離培養得到的是上皮細胞(腺細胞)和肌上皮細胞(導管細胞，圖3)。

圖3 原代培養大鼠淚腺細胞的鑒定(×200)

討 論

淚腺的主要功能是分泌水、電解質和蛋白質，形成淚液膜的親水層，保持眼睛濕潤并維持眼部健康[8]。在淚腺中存在3種主要的細胞類型，包括腺泡和導管上皮細胞、肌上皮細胞和間充質細胞[13, 14]。腺泡上皮細胞在分泌水、電解質和某些蛋白質中起重要作用[15]。肌上皮細胞圍繞腺泡和導管細胞，以維持腺泡完整性并刺激分泌產物從腺泡細胞中進入導管。間充質細胞起結構和支持作用，包括間充質干細胞、分化的成纖維細胞和分化的脂肪細胞[16]。腺泡上皮細胞和肌上皮細胞對淚腺功能都有重要作用。本研究采用簡單經濟的方法分離出淚腺上皮細胞。首先利用不同類型細胞的貼壁時間不同去除掉成纖維細胞，重復該操作可達到純化細胞的目的。然后采用膠原蛋白Ⅰ包被培養瓶以及在培養基中補充CT以維持淚腺細胞形態和上皮表型。值得注意的是CT對維持細胞上皮形態有重要作用，已有研究發現原代培養的上皮細胞在未添加CT的培養基中呈現單層多邊形形態但是傳代后形態明顯改變，而在添加CT的培養基中傳代后多邊形形態仍可維持[12, 13]。

筆者選取不同的細胞標志物對分離培養的細胞進行鑒定。CK是位于上皮細胞的中間細絲蛋白，在不同腺上皮和導管上皮中的表達模式差異較大，研究發現腺上皮細胞表達CK-5、CK-7和CK-19[17～19]。由于尚未有特異CK在大鼠淚腺上皮表達的報道，在本實驗中采用了pan-CK作為檢測抗體。E-鈣黏蛋白是上皮細胞標志物，在人淚腺中有明顯表達[20]。Vim是間充質細胞的主要細胞骨架成分，常表達于成纖維細胞、內皮細胞。α-SMA是收縮細胞比如肌細胞、肌上皮細胞的主要骨架蛋白，而S100蛋白是一種酸性鈣結合蛋白，由2個亞基組成，在肌上皮細胞中大量表達，是肌上皮細胞標志蛋白[13]。對細胞鑒定結果顯示，本研究分離得到的細胞高表達CK和E-cad，弱表達α-SMA和S100蛋白，基本不表達Vim，提示這些細胞表現為上皮細胞和肌上皮細胞的混合群體。上皮細胞和肌上皮細胞對維持淚腺功能都有有益的作用，基于此，對這兩種細胞所占比例尚未進行分析，這也是本實驗的一個不足之處。目前尚無淚腺腺泡細胞的特異性表面標志物，腺泡細胞屬于上皮細胞，因此本研究采用上皮細胞標志物作為鑒定標記，但是淚腺腺泡細胞能特異性分泌lacritin和β-hexosaminidase，由于這兩種物質是分泌物，在細胞中不便于檢測，因此未作為鑒定標記。此外，如果是未成熟的淚腺細胞也會表達祖細胞的標志物，例如Ki-67、Pax6等[21, 22]。

綜上所述，本研究成功建立了從大鼠淚腺分離培養淚腺上皮細胞的方法，為淚腺疾病，尤其是干眼病和干燥綜合征的研究提供了一種穩定、經濟的體外模型。