間歇性禁食對小鼠腦缺血再灌注TLR4/NF-κB通路的作用

王欣格 劉恒方 田建榮 王成名 張 敏

腦血管病是常見的腦部疾病,復發率和病死率高。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)在腦血管病中占主要地位,其可以導致神經元變性、壞死或凋亡,并且產生炎性反應[1]。其中炎性反應在缺血再灌注損傷中起關鍵性作用。既往研究發現，TLR4/NF-κB信號通路是炎癥形成的主要信號通路。一些內生的配體通過激活TRL4受體激活NF-κB，導致其釋放促炎細胞因子[2]。而腦缺血再灌注損傷后可以使NF-κB信號通路激活,促進炎性因子的大量表達,腦組織損傷進一步加重[3]。禁食是一種新的食物攝入方式，包括飲食限制(dietary restriction，DR)、熱量限制(caloric restriction，CR)、間歇性禁食(intermittent fasting，IF)[4]。近20年來，多項研究發現IF和CR可以延緩衰老，減少腫瘤及心腦血管疾病，增強生物體承受后續壓力的能力[5,6]。

本研究旨在通過間歇性禁食，觀察小鼠局部CIRI后神經功能缺損評分及TLR4、NF-κB的表達，從動物試驗的角度探討間歇性禁食對CIRI是否具有抗炎作用，從而為缺血性腦血管病的預防性治療提供新的臨床思路。

材料與方法

1.材料:(1)動物：健康6～7周齡雄性KM小鼠，清潔級，體質量為20～25g，喂養于鄭州大學第五附屬醫院中心實驗室SPF動物室[實驗動物許可證號：SCXX(豫)2019-0002]。(2)試劑：兔抗小鼠TLR4一抗，兔抗小鼠NF-κB p65一抗(武漢三鷹有限公司)；HE(蘇木精-伊紅)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。(3)儀器：手術顯微鏡購自北京中西遠大科技公司；電泳及轉膜槽購自美國Bio-Rad公司；高精度電子天平購自北京生物儀器有限公司；全自動包埋機購自Leica公司；顯微鏡及其圖像分析軟件購自德國Carl Zeiss Jena公司；血糖測量儀、血糖試條(葡萄糖脫氫酶法)購自北京怡成生物電子技術股份有限公司。

2.分組：將小鼠隨機分成3組，15只/組。分別為間歇性禁食組(IF組)、正常飲食組(CIRI組)和假手術組(Sham組)。IF組16：00時至次日8:00時禁食，其余時間隨意進食，24h自由飲水。CIRI組及Sham組均24h隨意進食。

3.小鼠體質量及血糖測量：第0天、第3天、第7天、第11天、第14天15:00時左右用稱重儀器測量體質量并記錄，同時檢測各組隨機血糖情況。

4.小鼠腦缺血再灌注模型制備：參考Longa等[7]線栓法堵塞小鼠大腦中動脈構建小鼠腦缺血再灌注模型，各組預處理完畢后，麻醉小鼠，用碘伏消毒頸部皮膚后縱行切開，暴露術野，在顯微鏡下分離出頸動脈，結扎近心端，在其分叉處打活結，之間再打1個單結。在外科結和活結處剪口，插入線栓后將單結固定，線栓插入1.5cm時停止，固定，打結，縫皮。1h后，將線栓拔出少許，多余部分剪掉。各組模型制備成功約24h后，進行下一步實驗操作。Sham組除不插入線栓外，手術步驟相同。術后各組小鼠均在23℃條件下復蘇，此時均不控制進食。

5.Longa神經功能評分:小鼠造模24h后，參考Longa等(0～4分)5分制對小鼠進行神經功能缺損評分[7]。評分標準:0分：無肢體偏癱、活動正常者;1分：左側前爪不能完全伸展；2分：行走時向左轉圈；3分：爬走時身體向左傾倒；4分：不能行走，意識喪失。其中，0分及4分小鼠均棄用。

6.病理組織切片制備:各組隨機選取6只小鼠，心臟灌流直至血液變為清澈，隨后用4%多聚甲醛固定至小鼠四肢及軀干僵硬為止。取腦組織，4%多聚甲醛4℃固定24h后，依次完成脫水步驟，隨后進行后續包埋等操作。

7.蘇木精-伊紅(HE)染色:石蠟切片按HE染色步驟經脫蠟、脫水、染色、沖洗、中性樹膠封片,光鏡下觀察腦組織細胞形態。

8.免疫組織化學染色檢測NF-κB p65及TLR-4的表達:腦組織切片經脫蠟、脫水、PBS反復沖洗等步驟后再進行抗原修復,5%BSA封閉30min,棄去，加入一抗工作液,放于4℃冰箱過夜;次日復溫30min，沖洗,滴加二抗,室溫孵育30min,沖洗,滴加DAB顯色,中性樹膠封片。顯微鏡下用高倍鏡觀察，每張切片隨機選取3個高倍鏡視野進行細胞陽性計數。

結 果

1.體質量及血糖：IF組、CIRI組、Sham組的體質量較分組處理前均增加。最初3天，各組小鼠的體質量無明顯變化。7天后，與IF組比較，CIRI組和Sham組的體質量均有明顯增長，但CIRI組與Sham組體質量變化比較，差異無統計學意義，各組的隨機血糖變化比較，差異無統計學意義，詳見圖1。

圖1 小鼠體質量及血糖變化

2.神經功能評分：與Sham組比較，IF組及CIRI組神經功能評分明顯改變，均有不同程度的神經功能缺損。與CIRI組比較，IF組神經功能評分明顯下降，詳見圖2。

圖2 小鼠神經功能評分與IF組比較，*P<0.05；與CIRI組比較，#P<0.05；與Sham組比較，▲P<0.05

3.HE染色情況：(1)IF組：缺血半暗帶及海馬CA1區神經元細胞深染明顯減輕，細胞皺縮及細胞形態明顯改善，細胞損傷程度較CIRI組明顯改善。(2)CIRI組：缺血半暗帶及海馬CA1區神經元細胞體積縮小，細胞深染皺縮，與周圍分界不清，細胞核固縮深染。(3)Sham組：缺血半暗帶及海馬CA1區細胞形態正常，結構完整。詳見圖3、圖4。

圖3 腦缺血半暗帶HE染色圖(×400)

圖4 海馬CA1區HE染色圖(×400)

4.TLR4、NF-κB免疫組化表達情況:鏡下觀察，呈棕黃色顆粒物質的為陽性信號。IF組及CIRI組：腦組織TLR4及NF-κB 顯著表達。Sham組：腦組織細胞TLR4及NF-κB 微弱表達。與Sham組比較，CIRI組的TLR4及NF-κB 呈強陽性表達，IF組也呈較強陽性表達。與CIRI組比較，IF組的TLR4及NF-κB的表達明顯降低，差異有統計學意義,詳見圖5～圖7。

圖5 TLR4免疫組化表達情況(×400，棕黃色顆粒為陽性細胞)

圖6 NF-κB免疫組化表達情況(×400，棕黃色顆粒為陽性細胞)

圖7 免疫組化結果

討 論

隨著腦血管病發生率的逐年升高，在腦血管病中占比極高的CIRI也被越來越多地研究，目前關于CIRI的發病機制，主要包括內質網應激、炎癥和凋亡等，其中炎癥和氧化應激是導致CIRI的主要因素[8～10]。熱量限制指的是攝食種類正常，總量減少30%～40%，同時保證必須氨基酸的攝入，具有簡單易施，無藥物毒性不良作用等優點[11，12]。其中，IF是熱量限制較為常用的方案。研究表明，CR可減少炎癥和NF-κB信號表達并且對炎性反應具有重要作用[13]。

吉曄楠[14]研究發現，對小鼠進行8周的熱量限制可減小心肌缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積，使心肌缺血再灌注損傷得到明顯改善，同時也發現CR對心肌缺血再灌注損傷的保護與抑制TLR4/NF-кB通路激活有關。未造成小鼠的明顯損傷，還能優化小鼠的基本生理指標，本實驗經過14天的間歇性禁食，各組小鼠體質量均顯著增加。前3天，3組小鼠體質量變化均不明顯，這可能與禁食期間攝食不足有關。7天后，各組體質量變化出現明顯差異，多考慮為IF組小鼠習慣禁食方案，開始自我調節以保證能量需求。各組小鼠血糖比較差異無統計學意義，說明間歇性禁食未對小鼠血糖造成明顯影響，兩項研究結果相似，說明IF不會造成小鼠生理功能等的損傷。任晉軍[15]研究發現，在建立肝缺血再灌注模型前對小鼠進行IF3個月，可以抑制NF-κB信號通路及肝組織TLR4的表達，對肝臟的缺血再灌注損傷有保護作用。以上研究均證實CR可能通過抑制炎性反應來減輕機體缺血再灌注損傷的程度。但是間歇性禁食在腦缺血再灌注損傷中TLR4/NF-κB通路的抑制作用研究較為罕見。

Varendi等[16]研究發現，在大鼠模型造模前，給予大鼠3天禁食或者6天無蛋白飲食，與正常飲食組比較，可以減少腦梗死面積，改善腦缺血再灌注損傷。也有研究證實，在進行大腦中動脈阻斷術前進行40 周的禁食能夠減少大鼠腦組織的梗死面積，降低腦卒中后的病死率[17,18]。本實驗采用tMCAO模型，發現與Sham組比較，CIRI組小鼠神經功能缺損評分明顯升高，表明模型組腦缺血再灌注損傷嚴重，提示造模成功。與CIRI組比較，IF組小鼠神經功能缺損評分明顯下降，表明IF組可有效改善小鼠行為學，減輕腦缺血再灌注損傷程度。同時，HE染色顯示，與CIRI組小鼠比較IF組腦組織缺血半暗帶區及海馬CA1區細胞深染及皺縮明顯減輕，細胞形態改善，說明IF可減輕腦組織壞死程度，緩解腦組織損傷。本實驗研究結果與這些實驗研究結果相同，表明間歇性禁食可減輕腦缺血再灌注損傷程度。

有研究表明，預防性IF可能通過抑制NF-κB信號通路減輕炎性反應及調節免疫應答，曹參祥等實驗采用TLR4功能缺陷的小鼠，制作小鼠大腦中動脈再灌注模型，并對比神經功能缺損評分及TLR4表達等情況，發現TLR4功能缺陷的小鼠CIRI程度比TLR4表達正常的小鼠明顯減輕[19,20]。本實驗從免疫組化結果可看出CIRI組中TLR4及NF-κB 陽性細胞呈現棕黃色顆粒,呈強陽性表達。IF組陽性細胞表達較CIRI組顯著減少，提示IF與TLR4/NF-κB通路有聯系,減輕了腦缺血再灌注的損傷程度，這與曹參祥等[20]、吉曄楠[14]及任晉軍[15]的研究結果類似，表明IF可能通過抑制TLR4/NF-κB通路從而減輕腦缺血再灌注損傷程度，起到神經保護的作用。

綜上所述，本研究證實，IF可能通過抑制TLR4、NF-κB的表達，來減輕CIRI造成的損傷，發揮神經保護作用，可為臨床治療提供新的思路。但間歇性禁食也存在患者難以堅持、依從性差等問題，后續可繼續尋找替代療法或加強患者依從性的方案，以尋求更好的治療效果。