氨基末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）化學發光免疫凍干微球定量檢測試劑研究

陳珠金

（安邦（廈門）生物科技有限公司，福建廈門 361000）

腦鈉肽（Brain Natriuretic Peptide，BNP）實際上主要來源于心室，因其由日本學者SUDOH[1]1988年首次從豬腦中提取出來而得名。BNP主要由心室肌細胞合成和分泌，具有較強的舒張血管作用，可抵御容量負荷過重及高血壓，心室負荷增加能導致BNP釋放。氨基末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）是腦鈉肽前體之一，是BNP激素原分裂后沒有活性的N-末端片段，主要由左心室分泌。與BNP相比，NT-proBNP半衰期更長，更穩定，其濃度可反映短暫時間內新合成的而不是貯存的BNP釋放。近年來的研究表明，血清NT-proBNP水平在高血壓診斷、心力衰竭的預后判斷與治療指導方面有重要價值[2-3]。

化學發光法檢測NT-proBNP能做到定量檢測，但發光免疫試劑在保存和運輸條件上要求苛刻，一般需要保存在2～8 ℃，需要冷鏈運輸。這些條件如果得不到滿足，會對發光免疫試劑的性能造成很大的影響，甚至導致試劑失效。本文研制的試劑可實現常溫儲存且單人份包裝，以羧基修飾的磁性微球偶聯NT-proBNP Ab1，利用吖啶磺酰胺標記NT-proBNP Ab2，添加試劑儲存劑，二者混合，利用液氮點樣儀器點樣，形成冷凍微球，將冷凍微球轉入凍干機，真空冷凍干燥后充保護氣體分裝保存。檢測時，加入純化水與待測樣本，等到待測物中的NT-proBNP抗原與試劑混合后，形成雙抗體夾心復合物結合在磁珠上，清洗分離，復合物在激發液的作用下發光，相對發光強度（RLU）與樣本中的NT-proBNP抗原濃度呈正相關。從而研制出直接化學發光免疫分析法定量檢測氨基末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）的凍干微球單人份包裝試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

NT-proBNP配對抗體，菲鵬生物股份有限公司；NT-proBNP校準品，上海領潮生物科技有限公司；人血清白蛋白、膽紅素、血紅素、甘油三酯，Sigma-Aldrich公司；磁性微球（羧基，2.9 μm），日本JSR株式會社；吖啶磺酰胺（NSP-SA-NHS），深圳市美凱特科技有限公司；脫鹽柱，Thermo Fisher公司；二甲基甲酰胺（DMF）、賴氨酸、酪蛋白、牛血清白蛋白BSA，Sigma-Aldrich公司；甘露醇、海藻糖、明膠、硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙二醇PEG20000，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 實驗儀器

SMART 500全自動化學發光測定儀，重慶科斯邁生物科技有限公司；1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.1.3 臨床樣本

定值人血清100例（福建醫科大學附屬協和醫院提供，定值結果由羅氏電化學發光檢測）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制方法

（1）試劑儲存液配制：甘露醇5%，海藻糖10%，酪蛋白1%，吐溫20 0.01%、明膠0.5%以及防腐劑0.1%，硫代硫酸鈉5 mmol/mL；乙二胺四乙酸二鈉5 mmol/mL，用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）（pH7.0～7.4，50 mmol）溶解稀釋以上組分到相應的濃度。

（2）激發液配制：激發液A為0.1%的H2O2+0.1 mol/L的HNO3，激發液B為0.2 mol/L的NaOH+1%的TritonX-100。

1.2.2 磁性微球偶聯NT-proBNP-Ab1制備（試劑A）

取10 mg羧基修飾的磁性微球混懸液于樣品管中，加入900 μL的2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）溶液（pH5.0，0.1 mol/mL）混勻，然后分別加入100 μL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）溶液（10 mg/mL）和200 μL的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）溶液（10 mg/mL），室溫反應30 min，活化磁性微球；去上清，磁珠重新混懸液于1 mL的MES溶液（pH5.0，0.1 mol/mL）；隨后直接加入100 μg的鱗癌抗原抗體1，37 ℃孵育3 h；去上清，加入50 μL的BSA（10 mg/mL）室溫封閉1 h后，用0.025 mol/mL的TBST（即 TBS with Tween-20，含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20 這3種物質）緩沖液洗滌4次，除去游離抗體，加入試劑儲存液10 mL，制備成試劑A。

1.2.3 吖啶磺酰胺標記NT-proBNP-Ab2制備（試劑B）

取適量抗體，用碳酸鹽緩沖液（pH9.6，50 mmol/L）稀釋至1 mg/mL，脫鹽柱純化；計算抗體的摩爾數，在純化后的抗體中加入15倍摩爾數的吖啶磺酰胺（DMF稀釋），4 ℃避光反應1 h；加入20倍抗體摩爾數的賴氨酸避光反應30 min，用高效液相色譜（流動相為pH6.5、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，分子篩色譜柱，檢測波長280 nm）純化標記后的復合物，加入等體積甘油在-20 ℃凍存，使用時用試劑儲存液稀釋至抗體濃度為0.001 mg/mL，制備成試劑B。

1.2.4 試劑點樣凍干

試劑A與試劑B按1∶1混合均勻，加入到液氮點樣儀中，設置點樣量每滴為20 μL，點樣形成冷凍微球，將冷凍微球轉入凍干機，冷凍干燥后充保護氣體分裝保存。

1.2.5 樣品檢測

30 μL待測樣本和120 μL去離子水加入到帶有凍干微球試劑的樣品杯中；37 ℃條件下溫育10 min后，洗滌液清洗3次，最后加入激發液A和激發液B各100 μL，檢測相對發光強度。

1.2.6 數據分析

在免疫反應中，對NT-proBNP采用3個平行孔測定后取其平均值，相對發光強度（RLU）和相應濃度進行4參量擬合，建立主校準曲線，掃描到儀器中。通過所保存的校準數據，檢測相應樣本時系統軟件自動地確定病人的測試結果，結果單位以pmol/mL的形式給出。

2 結果與分析

2.1 試劑外觀及理化性質

試劑呈均勻光滑的圓球狀固體，加純化水，微球迅速崩解復溶成均勻帶有磁珠粉末的混懸液，磁珠不團聚，液體除磁珠粉末外無其他未溶解物。

2.2 線性范圍

將接近線性范圍上限標準品（35 000 pmol/mL）的樣本用正常人血清稀釋6個濃度，其中稀釋的最小濃度20 pmol/mL接近線性范圍下限。對每一個樣本均檢測3次，計算平均值，相對發光強度值做直線擬合。如圖1所示，線性范圍（20～35 000 pmol/mL）內，線性相關系數R2=0.999，顯示了良好的相關性。

圖1 化學發光法凍干微球試劑測定NT-proBNP的標準曲線

2.3 最低檢出限

用零濃度校準品作為樣本進行檢測，重復測度20次，得出20次檢測結果的RLU值，計算其平均值（）和標準差（SD），將+2SD所對應的RLU值帶入主校準曲線中，求出對應的濃度值，結果不高于20 pmol/mL，因此設定20 pmol/mL即為最低檢出限。

2.4 精密性

批內精密性，用1 000 pmol/mL和10 000 pmol/mL濃度NT-proBNP，每個濃度平行檢測10次，分別求其平均值和標準差（SD），求得批內變異系數＜5%。

2.5 回收率

將3例高值樣本加入到3份正常人血清樣品（內源性檢測濃度均低于100 pmol/mL）中，所加入高值樣本與正常人血清之間體積比為1∶9，平均回收率95.7%。

2.6 穩定性

將試劑在45 ℃放置90 d，檢測NT-proBNP，相對發光強度與放置前對比，確定45 ℃儲存90 d熱穩定性的變化幅度≤10%；按試劑儲存條件（25 ℃±5 ℃）放置5個月，檢測標準品，相對發光強度與放置前對比，穩定性的變化幅度≤10%。本方法制得的試劑與常規化學發光試劑相比穩定性顯著升高。

2.7 比對試驗

收集福建醫科大學附屬協和醫院提供的57例臨床標本，用研究試劑盒測定，并與羅氏電化學發光測定結果對比，結果如圖2所示。回歸方程y=0.994 2x+173.13，相關系數R2=0.976 4，表明兩者測試血清中NT-proBNP抗原的含量具有良好的相關性。

圖2 本研究試劑檢測結果與羅氏電化學試劑檢測結果相關性

2.8 特異性

如表1所示，通過對常見的干擾因素（人血清白蛋白、甘油三酯、血紅素、膽紅素以及BNP）對檢測結果的影響判定方法的特異性，干擾物測定值均小于20 pmol/mL，表明該方法具有良好的特異性。

表1 試劑特異性分析

3 結論

近年來，我國心力衰竭發病率不斷升高，有資料顯示我國患有心血管疾病的患者約為2.9億人，其中心衰患者約占15.5%[4]。在臨床治療中，早期診斷具有重要價值，可有效控制患者病情，避免患者病情加重。臨床研究證實，當發生心力衰竭時，NT-proBNP水平均會顯著上升，其幅度與心力衰竭的嚴重程度正相關；病情緩解或有效治療后回降，但難以完全恢復到健康人水平。因此NT-proBNP的檢測是心力衰竭患者鑒別診斷、預后評定和指導治療中的重要指標。研究提出，NT-proBNP濃度對早期心衰患者具有診斷價值[5]。

化學發光免疫分析（Chemiluminescence Immuno-Assay，CLIA）是在世界范圍內發展非常迅速的非放射性免疫分析技術，可以根據化學反應產生的發光強度確定物質的含量，該方法在生物醫學研究和臨床檢測中已經得到廣泛的應用[6]。凍干工藝可有效解決發光免疫試劑不能常溫保存與運輸的問題。

本文成功研制了可實現單人份包裝常溫儲存的化學發光免疫試劑，具有靈敏度高、特異性好、線性范圍廣，穩定性好，可常溫儲存等特點，能夠滿足臨床檢測的需要，指導心衰患者的臨床診斷和治療，為患者治療提供可靠的數據支持。