匹伐他汀鈣光降解雜質的合成

林輝，王正澤，陳慧（南京長澳醫藥科技有限公司，南京 210038）

匹伐他汀鈣，化學名為（＋）-雙-｛（3

R

，5

S

，6

E

）-7-[2-環丙基-4-（4-氟苯基）-3-喹啉基]-3，5-二羥基-6-烯庚酸｝單鈣鹽，是由日產化學工業株式會社和日本興和株式會社共同研制的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，于2003年在日本上市，主要用于高膽固醇血癥和家族性高膽固醇血癥治療。他汀類原料藥如匹伐他汀鈣、氟伐他汀鈣、阿托伐他汀鈣和瑞舒伐他汀鈣等通常對光照敏感，原料藥及制劑產品在生產和貯存過程中若曝露于光環境中，會發生光環化和光氧化反應，分解成不同類型的降解產物。文獻報道匹伐他汀鈣經曝光可分解為（＋）-雙-｛（3

R

，6

E

）-7-[2-環 丙 基-4-（4-氟 苯 基）-3-喹 啉 基]-3-羥基-5-氧代-6-烯庚酸｝單鈣鹽（簡稱5-酮體，1）和（＋）-雙-｛（3

R

，5

S

）-5-[6-環 丙 基-7，8-二氫-10-氟苯并[k]菲啶-8-基]-3，5-二羥基戊酸｝單鈣鹽（簡稱閉環體，2）。匹伐他汀鈣及其光降解雜質結構式見圖1。

圖1 匹伐他汀鈣及其降解雜質的結構式Fig 1 Structure of pitavastatin calcium and its photodegradable impurities

由于匹伐他汀鈣對光照比較敏感，因此在工藝開發和處方研究時，需要考察光照對匹伐他汀鈣及有關物質的影響。高效液相色譜（HPLC）法可以準確直觀地反映各雜質的變化情況，是目前用于控制藥物有關物質的主要方法，但其前提是獲得被測雜質的對照品。本文主要研究了匹伐他汀鈣光降解產物1和2的制備方法，可以為匹伐他汀鈣原料藥及制劑工藝研究、篩選合適的遮光劑和包裝材料提供雜質對照品。

本課題組前期以匹伐他汀鈣為原料，經2，3-二氯-5，6-二氰對苯醌（DDQ）氧化，再經柱層析分離得到化合物1，總收率為28%。但該方法通過飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應，易析出大量固體，包裹產物，造成產物損失。DDQ氧化性較強，選擇性較差，除了氧化C-5位羥基外，還會繼續氧化C-3位羥基，生成副產物3，5-二酮體。DDQ在萃取或者柱層析工序中均不易去除，從而在產物中殘留。產物極性大，柱層析分離純化效果差，產物純度僅96.0%。本研究最初參照文獻方法，以二甲基亞砜為溶劑，采用二氧化錳（MnO）氧化匹伐他汀鈣制備化合物1，但HPLC檢測顯示無目標產物1產生。后嘗試采用鉻氧化物、高錳酸鹽、金屬銠絡合物和高價碘試劑氧化匹伐他汀鈣，但這些氧化劑選擇性差，副產物多，后處理復雜，產物難分離純化。本研究在文獻研究基礎上，選擇活性MnO氧化匹伐他汀游離酸得5-氧代匹伐他?。?），再在堿性條件下成鈣鹽制得化合物1。合成路線如圖2所示。該路線反應條件溫和，可選擇性氧化C-5位烯丙醇，不會引起雙鍵的異構化，反應收率高；反應液為非均相，后處理只需簡單地過濾；底物和產物為羧酸形式，產物易通過柱層析或者重結晶的方式分離純化。

Grobelny等將匹伐他汀鈣樣品溶液暴露于紫外光中，HPLC檢測到包含化合物2在內的4種光降解產物。文獻報道了其他他汀類結構如氟伐他汀鈣和瑞舒伐他汀鈣在水中通過陽光或紫外光照射發生環化反應，產生非對映異構體二氫苯并咔唑和二氫苯并喹唑啉結構，并通過制備HPLC分離出毫克級樣品用于結構確證。以上3種他汀類化合物均含鄰乙烯基聯苯結構，易發生光環化反應，生成穩定的類二氫菲結構，因此，本研究選擇光環化的方法制備化合物2，最初采用匹伐他汀鈣或匹伐他汀游離酸進行光環化，由于產物極性過大，柱層析分離純化效果差。Cermola等利用重氮甲烷進行甲基化制得甲酯，降低光降解產物的極性，再經制備HPLC分離純化。本研究參考上述方法，將匹伐他汀經對甲苯磺酸催化，分子內脫水內酯化得到匹伐他汀內酯（4），化合物4在光照條件下發生光環化反應制得內酯閉環體非對映異構體（5），再在堿性條件下水解、成鹽轉化為化合物2。合成路線如圖2所示。該路線選擇內酯結構作為底物進行光降解反應，產物極性降低，易分離純化；底物溶解度更高，溶液狀態有利于光環化反應。

圖2 匹伐他汀鈣5-酮體和閉環體的合成Fig 2 Synthetic routes of pitavastatin calcium 5-keto form and ring-closed form

1 儀器與試藥

7890型高效液相色譜儀、6200 Q-TOF型質譜儀（美國Agilent公司）；AV-500型核磁共振儀、AV-400型核磁共振儀（德國Bruker公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海光豪）。柱層析使用100～200目硅膠（青島海洋化工五廠，試劑級）。匹伐他汀鈣（江蘇天晟藥業有限公司，藥用級）；活性MnO（成都艾科達化學試劑有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 匹伐他汀的合成

在反應瓶中加入匹伐他汀鈣（80.0 g）、乙酸乙酯（400 mL）和水（200 mL），室溫下攪拌15 min。用10%鹽酸調節pH 3，繼續攪拌10 min，分液。水層用乙酸乙酯（100 mL×3）萃取。合并有機層用飽和氯化鈉溶液（200 mL）洗滌，經無水硫酸鈉干燥后抽濾，濾液減壓蒸除溶劑，得無色油狀物匹伐他?。?2.1 g，以匹伐他汀鈣計收率為94.2%）。

2.2 匹伐他汀鈣5-酮體（1）的合成

將匹伐他汀（30.0 g，71.18 mmol）溶于干燥二氯甲烷（300 mL）中分批加入活性MnO（116.3 g，1.07 mol），回流攪拌10 h。用硅藻土填充的漏斗抽濾，濾餅用二氯甲烷（50 mL×3）洗滌，合并濾液，減壓蒸除溶劑。剩余物經硅膠柱色譜[洗脫液為二氯甲烷-甲醇（80～20∶1）]純化剩余物得淺棕色油狀物3。加入水（180 mL），用1 mol·L氫氧化鈉調節pH為9。冰浴冷卻，滴加1 mol·L乙酸鈣（29 mL），攪拌1 h。抽濾，濾餅水洗滌，烘干，得淺黃色固體1（17.1 g，以匹伐他汀計收率為54.8%），純度為99.0%[HPLC歸一化法：色譜柱C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為pH 3.8醋酸鈉緩沖溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0→20 min：60%A，20→40 min：60%→30%A，40→65 min：30%A）；檢測波長245 nm；柱溫40℃；流速1.0 mL·min。相對保留時間1.3（相對于匹伐他汀鈣）]。mp. 139.6～140.6℃；H NMR（500 MHz，DMSO-

d

）

δ

：7.89（d，

J

＝8.35 Hz，1H，Ar-H），7.68（t，

J

＝7.45 Hz，1H，Ar-H），7.57（d，

J

＝16.5 Hz，1H，＝CH），7.31～7.43（m，6H，Ar-H），6.34（d，

J

＝16.5 Hz，1H， ＝CH），5.61（br，1H，CHOH），4.16（s，1H，CH），2.53～2.63（m，1H，CH），2.40～2.45（m，1H，CH），2.15～2.19（m，1H，CH），2.05～2.10（m，1H，CH），1.26（s，2H，CH），1.09～1.10（m，3H，CH）；C NMR（125 MHz，DMSO-

d

）

δ

：198.13（C＝O），177.90，162.81，160.86，159.68，146.49，145.34，138.41，134.43，132.04，131.88，129.74，128.38，127.31，125.99，125.83，125.14，115.50，115.33，64.97，55.98，47.85，43.78，18.48，15.86，10.69，10.66；HRMS-ESI calcd for CHFNO[M-Ca ＋2H]420.1606，found 420.1609。

2.3 匹伐他汀內酯（4）的合成

將匹伐他?。?0.0 g，23.73 mmol）溶于二氯甲烷（100 mL）中，加入一水對甲苯磺酸（0.5 g），回流攪拌4 h。冰浴冷卻，加入飽和碳酸氫鈉調節pH為7，分液。有機層用飽和氯化鈉溶液（50 mL）洗滌，經無水硫酸鈉干燥后抽濾，濾液減壓蒸除溶劑。剩余物用乙酸乙酯-正己烷重結晶，得類白色固體4（8.4 g，以匹伐他汀計收率為87.8%）。mp. 127.1～127.9℃；H NMR（500 MHz，CDCl）

δ

：8.05（d，

J

＝6.65 Hz，1H，Ar-H），7.67（t，

J

＝7.35 Hz，1H，Ar-H），7.31～7.45（m，2H，Ar-H），7.21～7.26（m，4H，Ar-H），6.77（d，

J

＝16.15 Hz，1H， ＝CH），5.69（dd，

J

＝1.65，16.15 Hz，1H，＝CH），5.22（m，1H，CH），4.28～4.30（s，1H，CHOH），2.72～2.76（m，1H，CH），2.62～2.66（m，1H，CH），2.40～2.45（m，1H，CH），2.2（br，1H，CHOH），1.84（d，

J

＝14.25 Hz，1H，CH），1.66（dd，

J

＝2.4，13.4 Hz，1H，CH），1.40～1.42（m，2H，CH），1.11（d，

J

＝7.9 Hz，2H，CH）；HRMS-ESI calcd for CHFNO[M＋H]404.1656，found 404.1663。

2.4 匹伐他汀鈣閉環體（2）的合成

將4（5.0 g，12.39 mmol）溶于二氯甲烷（1000 mL）中。將溶液裝入透明玻璃量瓶中，置于紫外燈下，365 nm波長照射5 d，減壓蒸除溶劑。剩余物經硅膠柱色譜[洗脫液為正己烷-乙酸乙酯（1∶1～2）]純化，得黃色油狀物5。將5（3.5 g，8.68 mmol）溶于乙腈（35 mL），加入1 mol·L氫氧化鈉（9 mL），室溫攪拌3 h，減壓蒸除溶劑。剩余物加入水（35 mL）稀釋，冰浴冷卻，滴加1 mol·L乙酸鈣（5.2 mL，5.2 mmol），攪 拌2 h，抽 濾，濾餅水洗滌，烘干，得黃色固體2（2.9 g，以4計收率為52.7%），純度為99.7%[HPLC歸一化法：色譜條件同1，兩個非對映異構體相對保留時間分別為0.53，0.55（相對于匹伐他汀鈣），以兩個非對映異構體峰面積總和計]。mp. 148.8～151.5℃；H NMR（500 MHz，MeOH-

d

）

δ

：8.39（t，

J

＝9.45 Hz，2H，Ar-H），7.95～8.00（m，4H，Ar-H），7.68（t，

J

＝7.1 Hz，2H，Ar-H），7.51～7.54（m，2H，Ar-H），7.32（d，

J

＝9.2 Hz，2H，Ar-H），7.17～7.21（m，2H，Ar-H），4.04～4.09（m，1H，CH），3.90～3.96（m，2H，CHOH），3.62～3.65（m，1H，CH），3.55～3.56（m，2H，CHOH），2.88～3.08（m，4H，CH），2.43～2.50（m，2H，CH），2.05～2.18（m，4H，CH），1.63～1.80（m，4H，CH），1.42～1.44（m，1H，CH），1.26～1.27（m，1H，CH），1.12～1.20（m，3H，CH），1.02～1.11（m，3H，CH）；C NMR，DEPT（125 MHz，MeOH-

d

）

δ

：180.22，180.19，164.92，164.83，162.25，161.43，149.01，148.85，145.55，144.78139.91，139.67，139.91，132.67，132.37，129.96，129.80，129.61，129.42，129.35，129.32，128.82，126.75，126.70，126.18，126.12，124.25，124.17，118.03，117.56，114.70，114.30，71.01（CH），69.70（CH），69.51（CH），69.00（CH），46.71（CH），45.06（2C，CH，CH），45.03（CH），43.00（CH），42.47（CH），26.71（CH），27.61（CH），15.87（CH），9.27（CH），9.89（CH），8.26（CH），7.73（CH）；F NMR（376 MHz，MeOH-

d

）

δ

： －114.1（s，Ar-F）， －114.7（s，Ar-F）；歸屬于其中信號較弱的異構體。HRMS-ESI calcd for CHFNO[M-Ca＋2H]422.1762，found 422.1758。

3 結果與討論

本文在文獻基礎上對化合物1的合成方法進行了改進。原料使用匹伐他汀游離酸代替鈣鹽，降低了底物和產物的極性，容易通過柱層析分離純化，產物純度提高到99.0%（文獻為96.0%）。氧化反應氧化劑用MnO代替DDQ，反應選擇性更高，反應后處理簡單。工藝優化發現反應溫度、MnO的用量和加入方式對反應速率、副產物含量和反應收率影響較大，反應溫度由室溫提高至40～50℃，大大縮短了反應時間；優化MnO的用量為15當量（以匹伐他汀計），通過分批加入MnO的方式，可減少副產物4的生成。市售MnO粒度較小，過濾時加入硅藻土助濾，可以提升過濾速度。合成總收率提高至52%（文獻為28%，以匹伐他汀鈣計）。

化合物1的高分辨率質譜（HRMS）實測值和計算值誤差在±0.0030之內，核磁共振氫譜（H NMR）和碳譜（C NMR）測試數據與文獻報道一致。

本文從匹伐他汀鈣光降解機制出發，首次報道采用光環化方法成功合成克級化合物2，總收率為44%，產物純度為99.7%。4的光環化反應遵循鄰乙烯基聯苯類化合物的光環化反應機制：第一步底物4經光照射發生環化，產生不穩定非對映異構體混合物4'；第二步，中間體4'由于失去芳香性，結構不穩定，會發生1，5-氫遷移反應，生成穩定的二氫苯并[k]菲啶結構5。反應機制如圖3所示。

圖3 化合物4光環化反應機制Fig 3 Mechanism of compound 4 photocyclization

化合物2的HRMS實測值和計算值誤差在±0.0030之內，HPLC和核磁共振氟譜（F NMR）分別顯示兩組峰，表明2為非對映體混合物，HPLC的紫外峰積分比例約1∶1，與文獻報道一致。徐敏等研究苯醚甲環唑非對映異構體發現，在核磁共振譜中非對映異構體相應的信號存在差別，特別是C NMR譜信號峰成對出現。2的H NMR譜中兩種構型C-6位碳原子上的質子化學位移分別為

δ

4.04～4.09和

δ

3.90～3.96，積分比例約1∶1，與HPLC的UV峰積分一致。C NMR譜顯示了50個信號，其中24組峰成對出現（一強一弱），2個重疊峰，分別對應非對映異構體中25個碳原子。DEPT譜顯示分子中含 5組仲碳、11組叔碳和9組季碳，符合2的化學結構式。與匹伐他汀鈣的NMR數據比較，發現其新增了一個附加環，少了一個烯鍵和一個芳香質子。

4 結論

本研究成功合成了匹伐他汀鈣5-酮體（1）和閉環體（2）兩種光降解雜質，并經核磁共振氫譜、碳譜、氟譜、DEPT譜和HRMS等確證結構，純度經HPLC檢測均在99.0%以上，可以作為匹伐他汀鈣原料藥及其制劑質量控制的對照品。