紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒的高效液相色譜指紋圖譜相關(guān)性研究

毛小文，祁梅，顧志榮*，馬轉(zhuǎn)霞，葛斌*，呂鑫，張銳（. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000；.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000）

紅芪為豆科植物多序巖黃芪（

Hedysarum polybotrys

Hand.-Mazz.）的干燥根，味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)，有補(bǔ)氣固表、利尿、排膿托毒、斂瘡生肌等功效，臨床上常用于治療氣虛乏力、中氣下陷、表虛自汗、氣虛水腫、癰疽難潰等癥。紅芪為甘肅十大隴藥之一，大面積栽培于隴南武都東南部山區(qū)地帶。現(xiàn)代藥理研究表明，紅芪中含多糖、黃酮、皂苷等多種生物活性成分，具有提高免疫力、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理作用。

以符合炮制標(biāo)準(zhǔn)的紅芪飲片為原料，通過現(xiàn)代提取、濃縮、噴霧干燥、制粒等技術(shù)制備成紅芪配方顆粒。但由于缺乏有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)測(cè)能力，導(dǎo)致配方顆粒成分不清，質(zhì)量參差不齊。《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》于2019年由國家藥監(jiān)局發(fā)布，該要求提出了“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”這一概念，作為衡量中藥免煎劑是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)，并指出藥材、飲片、中間體（浸膏或干膏粉）和免煎顆粒之間的特征性圖譜應(yīng)具有關(guān)聯(lián)性。目前，關(guān)于紅芪指紋圖譜的報(bào)道多集中于基原與炮制品的研究，但紅芪配方顆粒質(zhì)量全程控制尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究建立了紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的HPLC指紋圖譜，對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并考察四者之間化學(xué)成分的差異，旨在為紅芪配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片的可行性研究及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-16型高效液相色譜儀（日本島津）；BT125D型十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器）；DD-5M型低速大容量離心機(jī)（湘儀）；HH-6型恒溫水浴鍋（西安超杰數(shù)顯）；SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝）；YC-1000型實(shí)驗(yàn)室噴霧制粒包衣機(jī)（上海雅程）；DZF-6090型真空干燥箱（上海一恒）。

1.2 藥材

毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：CHB171102）、芒柄花苷（批號(hào)：CHB171026）、毛蕊異黃酮（批號(hào)：CHB171102）、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮（批號(hào)：CHB151026）（對(duì)照品，含量均≥98%，成都克洛瑪生物科技有限公司）；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純（天津大茂化學(xué)試劑廠）；水為超純水；15批紅芪藥材均購于甘肅隴南，見表1，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪

Hedysarum polybotrys

Hand.-Mazz.的干燥根，符合2020年版《中國藥典》一部相關(guān)規(guī)定。參照藥典中的紅芪炮制方法（除去雜質(zhì)，大小分開，洗凈，潤透，切厚片，干燥）將15批紅芪藥材炮制為紅芪飲片。

表1 15批紅芪藥材來源信息
Tab 1 Source information of 15 batches of Hedysari Radix

?

2 方法與結(jié)果

2.1 紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒中有效成分的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件色譜柱為Wondasil C-WR（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～7 min，15%～16%A；7～17 min，16%～18%A；17～19 min，18%～27%A；19～29 min，27%～29%A；29～31 min，29%～30%A；31～61 min，30%～60%A；61～63 min，60%～100%A），檢測(cè)波長280 nm，流速1.0 mL·min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫35℃。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含0.02、0.06、0.02、0.15 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，制備紅芪的標(biāo)準(zhǔn)湯劑（每克標(biāo)準(zhǔn)湯劑相當(dāng)于2.50 g飲片），編號(hào)H1～H15，具體方法如下：取紅芪飲片100 g，精密稱定，加9倍量水浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min，趁熱濾過；藥渣加7倍水煎煮，武火煮沸，文火保持微沸30 min，趁熱濾過，合并2次煎液，減壓濃縮，冷凍干燥得標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉未。

同法制得煎液，再減壓濃縮，噴霧干燥，制備同批號(hào)的配方顆粒（每克配方顆粒相當(dāng)于2.35 g飲片）。

稱取15批紅芪藥材粗粉6.0 g、飲片粗粉6.0 g（均過4號(hào)篩），標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末3.0 g、配方顆粒粉末3.0 g（研細(xì)），分別置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，補(bǔ)足失重，以4000 r·min離心10 min，取上清液，定容于25 mL量瓶中，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度混合對(duì)照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（

X

）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)（

Y

）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。

表2 各成分線性關(guān)系
Tab 2 Linearity of constituents

成分 回歸方程 r 線性范圍/（mg·mL－1）毛蕊異黃酮葡萄糖苷 Y＝1.18×107X－7.40×103 0.9995 0.0010～0.0080芒柄花苷 Y＝1.19×107X－1.36×104 0.9996 0.0030～0.0240毛蕊異黃酮 Y＝2.42×107X－9.05×103 0.9997 0.0010～0.0080 7-羥基-4'-甲氧基異黃酮 Y＝3.639×107X－6.30×104 0.9996 0.0075～0.0600

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)紅芪藥材供試品溶液（H1），連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮峰面積的

RSD

分別為1.3%、0.79%、1.4%、1.9%，表明儀器的精密度良好。2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紅芪藥材（H1），平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮峰面積的

RSD

值分別為2.8%、1.6%、2.6%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一紅芪藥材供試品溶液（H1），分別于0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮峰面積的

RSD

分別為1.4%、1.6%、2.4%、1.9%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取紅芪藥材（H1）約3 g，共取6份樣品，精密加入適量毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮對(duì)照品，置具塞錐形瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示紅芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮平均回收率分別為99.5%、100.1%、100.8%、99.6%，

RSD

分別為2.2%、1.8%、2.5%、1.3%，說明該方法回收率良好。

2.1.9 樣品含量測(cè)定 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定15批紅芪樣品，結(jié)果見表3。毛蕊異黃酮葡萄糖苷（A）、芒柄花苷（B）、毛蕊異黃酮（C）、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮（D）在15批紅芪藥材與飲片中的平均含量分別為13.56、25.33、9.90、185.46 μg·g與8.55、18.00、7.19、137.28 μg·g，紅芪藥材加工成飲片會(huì)有少量的成分損失，故紅芪飲片中4種有效成分平均含量略低于藥材；15批紅芪標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒中4種有效成分的平均含量分別為51.45、93.25、18.49、159.84 μg·g與36.16、60.26、15.88、119.09 μg·g，由于加入輔料故配方顆粒4種有效成分含量偏低。

表3 含量測(cè)定結(jié)果(μg·g)
Tab 3 Content determination (μg·g)

編號(hào) 藥材 飲片 標(biāo)準(zhǔn)湯劑 配方顆粒A B C D A B C D A B C D A B C D H1 14.22 25.24 10.65 178.06 9.72 23.33 9.42 171.49 43.92 84.25 15.96 133.44 31.24 71.56 17.56 123.02 H2 13.42 23.12 9.29 165.44 6.86 14.45 5.65 107.70 65.16 113.47 21.51 177.56 40.17 58.95 18.09 124.37 H3 12.85 32.88 11.61 216.59 9.62 15.42 5.76 115.55 54.58 83.13 19.40 155.33 41.29 62.91 19.53 128.77 H4 18.63 31.78 10.88 209.14 7.64 18.26 7.00 124.70 54.63 98.50 20.13 171.09 41.25 61.43 18.41 127.29 H5 12.37 22.33 9.56 192.94 7.51 14.82 5.88 117.67 66.64 109.55 21.88 187.34 36.64 53.42 14.91 117.25 H6 9.90 17.33 8.97 177.31 8.50 20.04 7.88 143.62 42.67 77.64 16.29 143.33 32.79 68.36 16.33 122.26 H7 11.24 22.72 9.93 189.66 9.67 21.45 8.89 169.40 24.75 75.49 15.47 140.80 38.06 48.43 11.80 121.70 H8 13.11 34.64 12.66 220.06 8.93 12.44 8.03 149.23 43.98 77.59 16.22 144.93 43.87 61.00 16.40 125.23 H9 11.39 17.88 6.83 141.80 8.32 18.96 7.20 144.78 41.35 73.49 15.98 145.39 37.29 67.32 14.69 113.40 H10 10.43 19.09 7.75 157.70 7.01 15.28 5.98 112.85 59.49 93.39 19.24 169.49 36.77 61.50 14.01 109.35 H11 10.28 19.21 7.57 148.00 8.61 20.56 8.56 138.45 53.05 78.51 16.77 153.16 23.68 57.21 15.48 118.63 H12 12.99 21.45 8.08 148.31 9.67 17.91 7.21 144.52 56.67 86.62 18.25 167.55 33.67 61.49 17.87 128.81 H13 17.12 29.29 10.47 198.82 8.19 18.20 7.22 137.24 61.51 103.62 18.58 165.32 37.24 64.20 15.14 114.44 H14 18.77 33.13 12.14 216.70 8.91 18.89 5.73 129.04 65.33 122.49 21.54 164.95 35.31 52.89 15.22 110.13 H15 16.67 29.87 12.11 221.34 9.15 19.92 7.47 153.02 37.96 121.01 20.10 177.89 33.14 53.25 12.73 101.65平均 13.56 25.33 9.90 185.46 8.55 18.00 7.19 137.28 51.45 93.25 18.49 159.84 36.16 60.26 15.88 119.09

2.2 紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒的HPLC指紋圖譜

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取“2.1.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 HPLC指紋圖譜的建立 15批紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒供試品溶液按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

圖1 15批紅芪藥材（A）、飲片（B）、標(biāo)準(zhǔn)湯劑（C）、配方顆粒（D）HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 15 batches of raw herbs，decoction pieces，standard decoction and dispensing granules of Hedysari Radix

2.2.3 相關(guān)性分析 將15批紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版），采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，選擇時(shí)間寬度為0.1。圖2為指紋圖譜。標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒共有14個(gè)色譜峰，但均未檢測(cè)到峰11、14、17、18；紅芪藥材、飲片共有17個(gè)色譜峰，但均未檢測(cè)到峰3。經(jīng)比較分析后確定紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒共有13個(gè)共有峰。通過與混合對(duì)照品紫外吸收及保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，確認(rèn)峰5、8、12、13分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮。因13號(hào)峰在紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒中分離度和峰高均最佳，故選擇該峰為參照峰。

圖2 混合對(duì)照品（S1）、紅芪配方顆粒（S2）、標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S3）、飲片（S4）、藥材（S5）的HPLC對(duì)照指紋圖譜比較Fig 2 HPLC reference fingerprint of mixed control（S1），dispensing granules（S2），standard decoction（S3），decoction pieces（S4），and raw herbs（S5）of Hedysari Radix

表4為紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒HPLC對(duì)照指紋圖譜相似度結(jié)果。紅芪配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜相似度為0.946，兩者有效成分差異很小，為紅芪配方顆粒質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

表4 紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒相似度結(jié)果Tab 4 Similarity of HPLC fingerprint of raw herbs，decoction pieces，standard decoction and dispensing granules of Hedysari Radix

樣品 藥材對(duì)照?qǐng)D譜飲片對(duì)照?qǐng)D譜標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照?qǐng)D譜配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜藥材對(duì)照?qǐng)D譜 1.000飲片對(duì)照?qǐng)D譜 0.988 1.000標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照?qǐng)D譜 0.799 0.765 1.000配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜 0.802 0.726 0.946 1.000

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取同一紅芪配方顆粒供試品溶液（H1），連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。以峰13為參照，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的

RSD

分別小于2.5%和1.6%，表明儀器的精密度良好。2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紅芪配方顆粒（H1），平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰13為參照，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的

RSD

分別小于1.7%和1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一紅芪配方顆粒供試品溶液（H1），分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰13為參照，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的

RSD

分別小于1.8%和2.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

本研究綜合考察了乙腈-甲酸水溶液和乙腈-磷酸水溶液在不同配比條件下色譜峰的峰形和分離度情況，以乙腈-0.3%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液及乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫時(shí)，乙腈-甲酸水溶液所得色譜峰的基線不平直，而乙腈-磷酸水溶液基線平直，出峰數(shù)量、保留時(shí)間和分離度良好；考察不同波長下（240、254、280 nm）的指紋圖譜，在280 nm條件下，所得峰面積、峰形、保留時(shí)間和出峰數(shù)量最佳。

3.2 指紋圖譜與特征峰

本研究共確定了13個(gè)共有特征峰，且能在5、8、12、13號(hào)峰位置與毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、7-羥基-4'-甲氧基異黃酮4種化學(xué)成分相對(duì)應(yīng)。通過對(duì)紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒HPLC指紋圖譜的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，紅芪的藥材和飲片中未發(fā)現(xiàn)3號(hào)峰，而該成分在標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒中均存在，而峰11、14、17、18在標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒中均未檢測(cè)到，但在紅芪藥材和飲片中均存在。這一現(xiàn)象可能是紅芪（藥材和飲片）在煎煮、濃縮和噴霧干燥過程中由于高溫導(dǎo)致其藥液中的一部分化學(xué)成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化，需要進(jìn)一步研究。

3.3 紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒之間的相關(guān)性評(píng)價(jià)

配方顆粒作為中藥飲片改革的新趨勢(shì)，具有免煎煮、方便攜帶等優(yōu)點(diǎn)。但經(jīng)制劑工藝加工而成的中藥配方顆粒已失去了飲片所具有的外觀辨別特征，在顯微結(jié)構(gòu)下也不易鑒別，并且以單一成分衡量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)很難反映配方顆粒的整體特征。中藥指紋圖譜能最大限度獲取配方顆粒、藥材及飲片之間的化學(xué)信息，高效地將中藥配方顆粒的內(nèi)在信息反饋在圖譜中，直觀觀察和評(píng)價(jià)內(nèi)在質(zhì)量。本試驗(yàn)建立紅芪藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜，考察其相似度，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜相似度分別為0.765、0.726，這可能與標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的制備過程中要經(jīng)過一系列的高溫（如煎煮、濃縮干燥）處理，導(dǎo)致一些成分產(chǎn)生變化（如3號(hào)峰的出現(xiàn)）有關(guān)。比較發(fā)現(xiàn)，紅芪藥材與飲片的相似度為0.988，配方顆粒和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度為0.946，表明藥材與飲片、配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑之間相似度良好，本研究可為配方顆粒替代標(biāo)準(zhǔn)湯劑提供參考。

4 小結(jié)

中藥湯劑療效顯著，但存在煎煮費(fèi)時(shí)、攜帶不便、保存困難等缺點(diǎn)。中藥配方顆粒解決了中藥湯劑的不足，作為中藥飲片的一種補(bǔ)充形式，逐漸被人們認(rèn)可。但中藥配方顆粒成分復(fù)雜，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以把控。本試驗(yàn)將紅芪配方顆粒和HPLC指紋圖譜相結(jié)合，可為紅芪配方顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。