鳳型大曲培曲階段不同部位理化指標動態變化及微生物群落演替規律分析

張 艷，孟勤燕，楊美媛，白莉圓，徐 晨，張永利，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西 鳳翔 721406）

中國白酒以其悠久的釀造歷史和獨特的釀造工藝形成了多個獨一無二的中國蒸餾酒品牌，因原料種類、工藝特點、主體香型等的不同被分為濃香型、鳳香型、醬香型、清香型、芝麻香型等品類。中國名優白酒都是開放式自然發酵[1]，通過自然富集篩選環境中的微生物而制得的大曲是白酒釀造中復雜微生物菌群的重要來源，作為白酒生產關鍵的糖化劑、發酵劑、生香劑，對出酒率及基酒的質量直接發揮影響作用[2-3]。濃香型白酒[4]、清香型白酒[5]、醬香型白酒[6]等在大曲理化功能、微生物體系、大曲與白酒風味間的關聯關系等方面已做了大量研究，全面了解了大曲培曲過程中各項指標變化規律，直接或間接證明了大曲在白酒生產過程中的關鍵作用。然而目前對鳳型大曲培曲過程中各理化指標與微生物動態變化更替之間的關系并不明了。因此，了解鳳型大曲培養過程中微生物群落結構演替規律，進而關聯到大曲的物理、化學指標，摸索微生物與曲質量之間的關系尤為重要。本研究將對鳳型大曲培曲過程進行全程跟蹤，全面了解其理化指標變化和微生物菌群結構變化規律，為鳳型大曲生產工藝調整和質量評判標準提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

鳳型大曲：選擇2019 年8 月下旬入房的38#、64#兩房大曲進行跟蹤研究。

試劑：三羥甲基氨基甲烷、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、乳酸、干酪素、己酸、丙酸辛酯等均為分析純。

儀器設備：冷凍高速離心機DH-2000R，上海德洋意邦儀器有限公司；紫外可見分光光度計TU-1810S，北京普析通用儀器有限責任公司；生化培養箱SPX-250-Ⅱ，上海龍躍儀器設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司；恒溫水浴鍋SYG-2S，常州朗越儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣

以0 d（入房）、2 d、6 d、10 d、14 d、18 d、22 d、28 d（出房）共8個時間點取樣，選擇靠近門、窗和中間三個位置作為取樣點，取曲塊外圍3 cm 樣品粉碎后作為曲皮樣，曲塊中心3 cm 半徑內樣品粉碎后作為曲心樣，具體取樣范圍如圖1 所示。采用四分法取樣，-20 ℃冷藏備用。

圖1 大曲取樣位點示意圖

1.2.2 理化指標檢測

溫度：將溫度計直接插入曲塊中心測量曲心溫度。

其他指標檢測：水分、酸度、淀粉、糖化力、發酵力、液化力、酯化力測定，參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

1.2.3 微生物群落多樣性檢測

大曲樣品送至上海派森諾生物科技有限公司進行高通量測序分析。

2 結果與分析

2.1 理化指標分析

2.1.1 曲心溫度變化規律

制曲溫度不同，產生的高級醇、醛類、酚類等風味物質種類也會有所不同，進而影響白酒風格[7-8]。從圖2 可知，大曲發酵時曲心溫度整體表現為前緩中挺后緩落，從第8 天以后進入大火期，維持4 d 左右，而后進入后火期，溫度逐漸降低，第18 天降至26 ℃，直至出房曲心溫度只是小幅波動。圖3 中64#房大曲曲心溫度變化趨勢和38#房相似。

圖2 38#房曲心溫度變化

圖3 64#房曲心溫度變化

2.1.2 水分變化規律

水在微生物代謝活動中是不可或缺的營養要素，大曲中水分的變化影響著微生物生長代謝和相關功能酶系的合成[9]。從圖4、圖5 可看出，38#曲房和64#曲房曲皮曲心水分變化基本一致。發酵前期至大火期曲皮水分迅速降低，大火期后直至出房水分變化不大；發酵初期曲心水分短暫上升后迅速降低，大火期后水分依舊降低，但速率明顯下降；整個發酵過程中水分由外向里逐漸擴散，曲心始終高于曲皮。

圖4 38#房曲皮曲心水分變化

圖5 64#房曲皮曲心水分變化

2.1.3 淀粉含量變化規律

淀粉是大曲培養過程中微生物生長繁殖、新陳代謝的重要營養物質，大曲中淀粉含量變化在一定程度上反映了微生物對淀粉的利用情況[10]。從圖6、圖7 可看出，發酵前期，微生物大量繁殖，曲皮曲心中淀粉被快速利用，但淀粉消耗速率有所差異。入房時強化菌液（霉菌、酵母菌的強化功能菌稀釋液）僅噴灑于曲皮，加之曲皮與空氣直接接觸，入房后曲皮微生物大量繁殖造成淀粉含量明顯下降；而曲心因內部供氧不足，微生物生長緩慢，淀粉利用速率較低。進入大火期后，高溫使曲皮曲心中大量微生物死亡，僅有耐高溫的得以存活，淀粉含量基本保持不變；收火后，品溫下降，部分細菌芽孢和霉菌的孢子開始逐漸萌發；直至后期，隨著溫度下降至室溫，細菌、酵母、霉菌、放線菌等微生物開始生長繁殖，但由于后期大曲中水分含量較少，微生物生長受限，淀粉含量變化不明顯。

圖6 38#房曲皮曲心淀粉含量變化

圖7 64#房曲皮曲心淀粉含量變化

圖8 38#房曲皮曲心酸度變化

圖9 64#房曲皮曲心酸度變化

大曲酸度形成來源于兩方面，一是生酸微生物代謝生成有機酸，二是微生物通過TCA 循環降解蛋白質、脂肪和淀粉形成各種酸類物質[11]。適當的發酵酸度，既能抑制病原菌和腐敗微生物，又能保證功能微生物的生長、糖化和發酵[12]。64#房大曲入房培養的第2～6 天曲皮酸度處于較高水平，主要原因是乳酸菌（豐度占比為51.75%～68.6%）大量繁殖代謝產生有機酸，發酵前期38#房大曲曲皮曲心酸度較高也是乳酸菌造成的。兩房大曲曲皮酸度在發酵初期迅速升高，大火期間隨著微生物大量消亡又迅速下降，而后曲皮酸度波動變化，曲心趨于穩定，主要是曲皮微生物在后期能繼續繁殖，曲心微生物生長受限所致。

2.1.5 糖化力變化規律

圖10 38#房曲皮曲心糖化力變化

圖11 64#房曲皮曲心糖化力變化

糖化力是糖化型淀粉酶將淀粉糖化生成葡萄糖的過程，其活力的高低直接關系到釀酒過程中淀粉的轉化率[13]。大曲入房時曲皮糖化力高達612 U，主要是因為大曲為生料發酵，大麥小麥豌豆自身就含有一定量的糖化酶。但原料中的糖化力易受溫度影響，不夠穩定[14]。入房前2天曲溫逐步上升，原料自身的糖化力下降，霉菌在曲皮表面大量繁殖，但尚未產生一定量的糖化酶[15]，所以糖化力有所下降。曲心霉菌在發酵前期較少且生長緩慢，原料中的糖化力不穩定，導致曲心糖化力出現大幅下降。隨著培養時間的延長，品溫升高，曲皮表面水分迅速散失，不利于霉菌的生長代謝，導致曲皮糖化力出現一定幅度的下降；曲心溫度雖不斷升高，但由于曲心內部水分依舊高于20 %，嗜熱子囊菌繼續生長代謝產生β-葡聚糖酶[16]，致使糖化力出現升高現象。發酵后期，曲皮環境依舊不利于霉菌的生長，糖化力呈下降態勢，進入晾架期后，少數耐干燥的微生物尚能發育，曲皮糖化力再次回升。由于發酵后期曲心水分不斷下降，環境惡劣，大部分微生物停止生長，直至出房，曲心糖化力處于較低水平。

2.1.6 發酵力變化規律

圖12 38#房曲皮曲心發酵力變化

圖13 64#房曲皮曲心發酵力變化

發酵力是大曲中酶系將糖類發酵后生成二氧化碳和酒精強弱的評價，主要受酵母菌影響[17]。在整個發酵階段，兩房大曲曲皮與曲心發酵力變化趨勢基本一致。入房時曲心發酵力主要與大曲原料本身含有的酵母菌有關，曲皮發酵力與大曲原糧、曲房微生物環境以及噴灑強化菌種有關。發酵前期，曲塊溫度適宜，水分氧氣充足，酵母菌等微生物大量繁殖，曲皮、曲心發酵力迅速升高。隨后曲心溫度逐漸升高，酵母活力下降，曲心發酵力迅速下降，進入大火期，曲心發酵力降至最低；曲皮升溫幅度較曲心小，對酵母菌影響不劇烈，發酵力出現小幅度下降。發酵后期，雖然曲心溫度和室溫逐漸降低，但由于曲塊整體含水量較低，不適宜酵母菌大量繁殖，導致發酵力波動變化且處于較低水平。從整個發酵過程來看，曲皮發酵力略高于曲心發酵力。

2.1.7 酯化力變化規律

圖14 38#房曲皮曲心酯化力變化

圖15 64#房曲皮曲心酯化力變化

酯化力是大曲發酵后形成的催化生酯的能力。從培曲過程來看，曲皮曲心酯化力變化規律基本一致。發酵前期，霉菌、酵母菌大量增殖，此時曲皮與曲心酯化力處于較低水平，進入潮火期后細菌代謝酶系增強，酯化力迅速升高，且38#房升高幅度大于64#房。兩房曲酯化力在第18 天左右達到最大，而后略微降低逐漸趨于平穩，直至出房，酯化力無較大變化，后期曲心酯化力高于曲皮。

2.2 鳳型大曲培曲階段微生物群落結構演替規律分析

2.2.1 真菌

水利建設工程由施工準備開始到竣工交付使用，要經過若干工序、工種的配合施工，而工程質量的形成不僅取決于原材料、構配件，同時也取決于各工種、工序的作業質量。為了實現對工程全方位、全過程的質量控制，按工程的形成過程，考慮設計的布局、施工布置等因素，將水利建設工程依次分為單位工程、分部工程、單元工程。項目劃分貫穿于工程建設的始終。

2.2.1.1 Alpha 多樣性分析

(1)培曲大曲中真菌的Alpha多樣性指數

通過Illumina高通量測序對酒醅發酵過程中的8 個樣本進行真菌多樣性分析，在97%相似度水平下對序列聚類并對OTU劃分，結果如下。

Alpha 多樣性是指一個特定環境或生態系統內的多樣性，主要用來反映單個樣品的物種多樣性、豐富度以及均勻度。表1中coverage是所有樣本序列的覆蓋率，其數值在0.999838～0.999999 之間，表明本次測序結果能完整反映培曲階段大曲中真菌菌群組成的真實情況。Chao1 和Observed_species 指數主要表征樣本中物種豐富度，其數值越大，表明樣本中包含物種的數目越多；Shannon 和simpson 指數主要表征樣本中物種多樣性，值越高表明樣本的多樣性越高[18-19]。

表1 培曲大曲中真菌的Alpha多樣性指數

由表1 可知，鳳型大曲培曲階段曲皮和曲心中真菌多樣性和豐富度隨著培曲時間的變化呈現不同的變化規律。入房大曲曲皮（Q0P）中真菌豐富度和多樣性明顯高于后期培曲階段，這是因為入房大曲中混入大量來自原料、環境、水中的真菌，使得曲塊中真菌豐富度和多樣性高；培曲的2～10 d 曲皮霉菌和酵母菌大量繁殖，曲塊溫度迅速上升，酸度也快速升高，此時部分不耐酸不耐熱的微生物大量衰亡或受到抑制，真菌多樣性和豐富度降低；培曲10 d 以后，霉菌和酵母菌增殖緩慢，大部分酵母菌衰亡，曲塊溫度和酸度逐漸降低后趨于穩定，部分細菌開始增殖，曲塊中微生物結構在經歷環境的淘汰選擇后逐漸平穩，因此曲塊中真菌群落多樣性和豐富度在培曲的后期相對穩定。入房時曲心微生物多樣性低于曲皮，主要因為曲皮表面噴灑了強化菌液且大量接觸環境，表明了環境微生物對大曲培養的重要作用；培曲前期曲心水分流失速度較緩，酸度上升幅度小，真菌種群豐富度和多樣性要高于曲皮；后期由于曲心內部溫度較高，含氧量不足等原因使得曲心真菌的微生物多樣性又低于曲皮。出房混合樣的真菌多樣性和豐富度要高于曲皮和曲心，這可能是因為曲皮和曲心樣本只能代表大曲曲塊表皮和最中心部位，而曲皮和曲心的中間過渡部位中微生物多樣性豐富。

(2)稀疏曲線

圖16 為鳳型大曲培曲階段真菌群落稀疏曲線，橫坐標為測序深度，縱坐標為OTU 數。曲線的平緩程度反映了測序深度對觀測樣本多樣性影響程度，通過稀疏曲線可以在相同測序深度下比較不同樣本中OTU 數量的多少，進而衡量每個樣本中物種多樣性高低[20]。由圖16 可知，測序深度在10000 以后樣本中0TU 數量增加趨勢平緩，稀疏曲線都已進入平臺期，表明測序深度合理，結果真實可靠。圖17 中入房大曲曲皮和曲心中真菌群落多樣性最高。

圖16 培曲大曲中真菌稀疏曲線

圖17 培曲大曲中屬水平真菌組成分布

2.2.1.2 物種分類學分析

大曲作為多菌種微生態制品，其所含微生物的種類和數量直接影響著白酒的產質量和風格特征[21]。從圖17 可看出，曲坯入房時真菌種類較多，第0 天曲皮與曲心在種群豐富度及占比關系上存在一定差異，曲皮以伊薩酵母屬（Issatchenkia）、鏈格孢屬（Alternaria）和威克漢姆酵母屬（Wicherhamomyces）為主，曲心以伊薩酵母屬、鏈格孢屬和畢赤酵母屬（Pichia）為主。兩者之間的差異主要由于曲坯入房后會在曲皮表面噴灑強化菌液，菌液難以立即滲入曲心。經過上霉階段，曲皮以伊薩酵母屬和畢赤酵母屬為主，曲心以伊薩酵母屬和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）為主。第6 天，曲皮曲心主要以伊薩酵母屬為主。溫度持續升高，大火期時，由于曲心溫度達到60 ℃，耐高溫的嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）占主導地位，而曲皮較曲心升溫速度慢，此時依舊以伊薩酵母屬為主，但嗜熱子囊菌屬所占比例逐漸升高。大火期結束時，曲心除嗜熱子囊菌屬外，其他真菌基本死亡，此時曲皮除了伊薩酵母屬和嗜熱子囊菌屬外，還有一定量的根霉（Rhizopus）。隨后溫度逐漸下降，其他真菌逐漸開始生長，曲皮曲心中嗜熱子囊菌屬相對豐度逐漸降低。從第22 天直至出房，曲皮以伊薩酵母屬和嗜熱子囊菌屬為主，還有一定量的曲霉屬（Aspergillus），此時，曲心溫度降至25 ℃左右，曲霉屬生長條件較適宜，開始大量繁殖。從出房混合大曲樣來看，其主要以嗜熱子囊菌屬、伊薩酵母屬和曲霉屬為主。從整個大曲發酵過程上來看，曲皮中優勢菌種主要為伊薩酵母，曲心在大火期之前優勢菌種為伊薩酵母，經過大火煉菌，嗜熱子囊菌屬成為優勢菌種，在發酵后期，曲霉屬開始大量繁殖，至大曲出房，曲心優勢菌種為嗜熱子囊菌屬和曲霉屬。嗜熱子囊菌屬、威克漢姆酵母屬對大曲糖化力和液化力的提升有積極作用，根霉對提升大曲酯化力作用明顯[22]。

2.2.1.3 物種組成熱圖

圖18 為大曲培曲過程中真菌組成熱圖，紅色越深表明物種豐度越大，藍色越深表明物種豐度越小[23]。由圖18可知，入房大曲的微生物組成與發酵期存在明顯區別，0 d 時大曲曲皮曲心中真菌種類較多，發酵開始后，大曲中真菌多樣性和豐富度迅速降低。入房曲坯中真菌種類繁多，來源于環境、原料、水等，發酵開始后，部分微生物因不適應曲房環境迅速衰亡，此時霉菌和酵母菌大量增殖；中后期隨著曲坯品溫升高，只有一些耐高溫的細菌及少量霉菌存活，大曲培養階段微生物菌群結構在與環境的淘汰和適應過程中逐漸穩定。

圖18 培曲大曲中屬水平真菌組成熱圖

2.2.2 細菌

2.2.2.1 Alpha 多樣性分析

(1)培曲大曲中細菌的Alpha 多樣性指數

通過Illumina高通量測序對酒醅發酵過程中的8 個樣本進行細菌多樣性分析。在97 %相似度水平下對序列聚類并對OTU劃分，結果如下。

培曲階段大曲中細菌群落多樣性及豐富度隨培養時間的不同有所變化。入房曲坯曲皮和曲心的Chao1 指數和Observed_species 指數都比較高，表明入房大曲中細菌多樣性高，培養2 d 后由于霉菌、酵母菌的大量增殖，曲塊酸度和溫度上升，部分細菌因不適應環境而大量衰亡，多樣性減小[24]。培養的6～18 d 是細菌大量繁殖時期，此時細菌菌落豐富度逐漸增大，種類增多；整體看大曲曲皮細菌多樣性和豐富度要高于曲心。

表2 培曲大曲中細菌的Alpha 多樣性指數

（2）稀疏曲線

圖19 為培曲階段大曲中細菌稀疏曲線，圖中曲線逐漸趨于平坦，表明測序深度基本合理，足以代表所有樣本信息。由圖19 可以看出，同一測序深度下，曲皮微生物多樣性要高于曲心。

圖19 培曲大曲中細菌稀疏曲線

2.2.2.2 物種分類學分析

相對于大曲中真菌的物種組成，細菌更為復雜。曲坯剛入房時，曲皮曲心物種組成差別較小。經過上霉階段，曲皮與曲心中羅斯伯里氏菌屬（Romboutsia）相對豐度增大，曲心醋酸桿菌屬（Acetobacter）相對豐度迅速提高，此時曲房內能夠明顯聞到酸味。大曲繼續培養，毛螺菌科NK4A136（Lachnospiraceae NK4A136）群組繼續繁殖，相對豐度繼續提高。大火期，曲心中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）大量死亡，相對豐度明顯降低，取而代之的為狹義的梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、貪銅菌屬（Cupriavidus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus），其中梭菌屬代謝生成的乙醇脫氫酶是參與乙醇生成的重要酶之一[25]。由于曲皮升溫速度低于曲心，除羅斯伯里氏菌屬相對豐度提高外，其他物種組成無明顯變化。大火期結束時，曲心中耐高溫的葡萄球菌屬占絕對優勢，此外還含有一定量的乳酸桿菌屬和狹義的梭菌屬等。曲皮乳酸桿菌相對豐度也明顯降低，魏斯氏菌屬（Weissella）明顯提高。大曲后火期，曲皮中魏斯氏菌屬相對豐度也處于較高水平。出房時，曲心中螺桿菌屬（Helicobacter）占絕對優勢，此外還含有大量的魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、乳酸桿菌屬和短桿菌屬（Brevibacterium）。曲皮中乳酸桿菌成為絕對優勢菌種，此外還含有大量貪銅菌屬、螺桿菌屬、魏斯氏菌屬、醋酸桿菌屬和鏈霉菌屬（Streptomyces）。出房混合大曲樣中乳酸桿菌屬為絕對優勢菌種，此外還含有大量的魏斯氏菌屬、毛螺菌科NK4A136群屬和瘤胃梭菌屬（Ruminococcus），出房混合樣中細菌組成主要為桿菌屬。

2.2.2.3 物種組成熱圖

大曲培曲過程中細菌結構組成對大曲酸度、酯化力等生化性能影響較大[26-27]。圖21 為鳳型大曲培曲過程中前20的細菌組成熱圖，紅色代表該屬在該樣本中豐度較高，藍色代表該屬在該樣本中豐度較低。熱圖組成可直觀反映發酵周期與主要細菌的相關性大小。由圖21 可知，大曲培養0～6 d 時，細菌結構組成較為相似，此時曲坯中細菌增殖緩慢，主要為霉菌和酵母菌的生長；培養6 d 之后大曲中細菌開始大量增殖，多樣性增加，曲皮曲心細菌結構組成存在差異。

圖20 培曲大曲中屬水平細菌組成分布

圖21 培曲大曲中屬水平細菌組成熱圖

3 結論

本試驗主要研究了鳳型大曲培曲過程中理化指標變化和微生物群落結構演替規律。結果表明，培曲過程中大曲理化指標變化與微生物群落結構演替關系密切。曲心溫度變化呈現“前緩中挺后緩落”趨勢，主要是微生物生長代謝釋放熱量，同時微生物對水分的利用使得曲坯中水分含量持續降低，且曲皮始終低于曲心；微生物增殖對淀粉的利用率在10%左右，曲皮消耗速率高于曲心；前期伊薩酵母的大量增殖使得曲坯酸度迅速升高，中后期酵母菌大量消亡，酸度降低；培曲過程中隨著微生物的消長，大曲糖化力、發酵力波動變化，曲皮整體高于曲心；酯化力在培曲的后期迅速升高，主要與后期細菌大量增殖有關。高通量測序結果顯示培曲大曲中細菌物種豐富度和多樣性大于真菌，曲皮細菌始終以Lactobacillus為主導，曲心優勢細菌不同時期有所不同；曲皮真菌以Issatchenkia為主，曲心前期以Issatchenkia為主，后期Thermoascus迅速增殖成為優勢菌；α-多樣性進一步表明大曲培曲過程中不同時期、不同部位微生物豐富度和多樣性存在差異。本文通過探究鳳型大曲培曲過程中不同部位理化指標和微生物群落結構演替規律變化，為鳳型大曲質量把控和品質提升奠定了理論基礎，將進一步科學指導西鳳酒的生產，提升其品質。