鎘污染條件下水稻對假單胞菌TCd-1微生物修復(fù)的生理響應(yīng)

文歡歡,鄭新宇,2,肖清鐵,2,汪敦飛,律其鑫,韓博倫,王玉潔,樊榮榮,游 武,郭尤睿,錢 鑫,林瑞余,2,*

1 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室,福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350002 2 作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點實驗室,福建農(nóng)林大學(xué), 福州 350002

鎘(Cd)是一種人體非必需的元素,具有潛在的“致癌、致畸、致突變”效應(yīng),極易通過食物鏈進入人體并富集,從而危害人體健康[1]。據(jù)《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示,我國耕地土壤重金屬污染點位超標(biāo)率高達(dá)15.5%,其中鎘的點位超標(biāo)率約為7%,居重金屬首位[2]。此外,水稻是我國主要糧食作物之一,但有研究表明,部分地區(qū)市售大米近10%存在鎘超標(biāo),已引起人們的高度關(guān)注[3]。稻米鎘超標(biāo)與我國農(nóng)田土壤鎘污染比較突出密切相關(guān),利用物理、化學(xué)、生物及其復(fù)合技術(shù)修復(fù)鎘污染土壤,降低稻米鎘含量,將為建立安全的水稻生產(chǎn)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為鎘耐性的假單胞菌(Pseudomonassp.)TCd-1(專利號:CN103952333A)[18],是課題組前期從水稻品種“PI312777”的根際土壤篩選得到,保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保存號:CCTCC M2013649)。菌懸液培養(yǎng)條件:牛肉膏0.5%,酵母粉1.0%,氯化鎂0.5%,pH 6.3,溫度33℃,接菌量1.25%,轉(zhuǎn)速160 rpm,培養(yǎng)24 h后用于接種。接種前取菌懸液100 mL分次在4℃、12000 rpm下離心15 min,去上清液,菌株沉淀物用無菌水稀釋至100 mL,稀釋后的菌液濃度測定為(5.33±0.24)×1010個/mL。

鎘高耐性水稻“特優(yōu)671”和鎘低耐性水稻“百香139”是課題組前期從238份近年我國主栽的水稻品種中篩選得到。供試水稻的種子用2.0%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min后,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至種子露白(期間定期補水),然后均勻播于沙盤中,待水稻長至3葉1心期時,選取長勢一致水稻用于盆栽試驗,每盆移栽水稻秧苗1株。

盆栽土壤取自福建農(nóng)林大學(xué)水稻實驗田,土壤鎘含量為0.18 mg/kg,土壤經(jīng)自然風(fēng)干、研磨,過篩2 mm后,分裝于(直徑18 cm,高15 cm)的深色塑料盆缽中,每盆2.5 kg,施入氮肥(以純N計)150 mg/kg、磷肥(以P2O5計)100 mg/kg、鉀肥(以K2O計)100 mg/kg,并在盆栽前進行10 mg/kg鎘添加處理,土壤混勻,保持水深2—3 cm,每日攪動1次,陳化4周后用于水稻栽培。

1.2 盆栽管理與采樣

盆栽試驗于2019年3月至8月在福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院玻璃房進行,設(shè)置4種處理:(1)CK:不加鎘、不接種假單胞菌TCd-1(2)Cd10:添加10 mg/kg鎘；(3)CKB:未加鎘,接種假單胞菌TCd-1；(4)Cd10B:添加10 mg/kg鎘,接種假單胞菌TCd-1。各處理5次重復(fù)。在移栽水稻返青后,進行接種,接種量20 mL/kg(即2%)。盆栽期間定期澆水,保持桶里水量高于土面2—3 cm,以保證水稻正常生長。在分蘗期、抽穗期、成熟期分別測定水稻的株高、凈光合速率；在抽穗期測定水稻根系活力、葉綠素含量、葉片抗氧化酶活性與抗氧化物質(zhì)含量、MDA與超氧陰離子含量；在成熟期測定水稻各部位的鎘含量。

1.3 測定方法

1.3.1水稻株高、生物量及凈光合速率的測定

在水稻分蘗期、抽穗期、成熟期,采用精度0.1 cm的直尺測定水稻株高；在成熟期將水稻全株取出后,用去離子水洗凈根部,再用吸水紙吸干,將樣品分為根、莖和葉三部分,置于烘箱105℃殺青0.5 h后,轉(zhuǎn)至72℃烘至恒重,測定其干重,生物量為根、莖、葉干重之和,3次重復(fù)。凈光合速率(Net photosynthetic rate,Pn)采用LI—6400便攜式光合測定儀(LI—COR公司,美國)測定,5次重復(fù)。

1.3.2根系活力和葉綠素含量測定

根系活力采用四氮唑(TTC)染色法測定[19],結(jié)果以TTC還原量(mg h-1g-1FW)表示,測定3次重復(fù)。葉綠素含量采用分光光度法測定[20]。

1.3.3抗氧化酶活性測定

1.3.4類黃酮和總酚含量測定

類黃酮含量測定采用甲醇提取和分光光度法[26]。準(zhǔn)確稱取新鮮去中脈水稻葉片0.5 g,加5 mL含1% HCl的甲醇溶液(甲醇∶水∶鹽酸=79∶20∶1),反應(yīng)30 min后,4℃提取24 h,取0.5 mL提取液,稀釋、定容至25 mL,在325 nm處比色測定吸光度(OD)值；總酚含量測定以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,再由280 nm處的OD值計算求得。總酚、類黃酮含量均以鮮重表示。

1.3.5水稻鎘含量的測定

鎘含量測定利用原子火焰分光光度法進行[27]。在成熟期,將水稻整株取出后,先用自來水沖洗根部土壤,再用去離子水洗凈,用吸水紙吸干后,將樣品分為根、莖、葉、糙米4個部位,裝入信封,置于烘干箱105℃殺青1 h后,72℃烘干48 h,樣品用瑪瑙研缽研碎,過100目篩,待測。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素(one-way ANOVA)和Duncan法進行方差分析和多重比較(P=0.05)。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 假單胞菌TCd- 1對鎘污染水稻各器官鎘含量的影響

結(jié)果表明,不同處理“特優(yōu)671”各部位的鎘含量高低為:根>莖>葉>糙米,不加鎘處理“百香139”表現(xiàn)為:葉>莖>根>糙米,加鎘處理的為:莖>根>葉>糙米；水稻不同部位的鎘含量在不同處理間均表現(xiàn)為:Cd10>Cd10B>CKB≈CK(表1)。在鎘處理下,“特優(yōu)671”根、莖、葉、糙米的鎘含量分別為35.72、9.69、4.34、0.84 mg/kg,接種菌株后依次下降了30.5%、39.1%、40.7%、29.2%(P<0.05)；“百香139”的分別為13.18、31.26、6.57、1.33 mg/kg；接種菌株后,依次下降了52.2%、51.7%、18.4%、38.8%(P<0.05)。可見,假單胞菌TCd-1處理后能夠顯著降低Cd10處理水稻中各器官的鎘含量(P<0.05)。

表1 不同處理水稻的鎘含量

2.2 假單胞菌TCd-1對鎘污染水稻株高和生物量的影響

如圖1所示,在分蘗期,CKB處理“特優(yōu)671”、“百香139”的株高分別為58.70、48.70 cm依次比CK處理提高了7.1%、20.3%；Cd10B處理的株高分別為41.33、35.66 cm,依次比Cd10處理提高了10.6%、17.1%。在抽穗期,CKB處理“特優(yōu)671”、“百香139”的株高分別為94.19、88.33 cm,依次比CK處理提高了8.4%、15.0%,Cd10B處理的株高分別為88.59、81.89 cm,依次比Cd10處理高10.2%、4.8%。在成熟期,CKB處理“特優(yōu)671”、“百香139”的株高分別為101.77、98.40 cm,依次比CK處理提高了11.9%、7.5%,Cd10B處理的株高分別為92.18、95.23 cm,依次比Cd10處理高6.7%、12.3%。加菌處理后“特優(yōu)671”的生物量無顯著性差異；CKB、Cd10B處理“百香139”的生物量分別顯著增加了29.72%,29.90%(圖1)。可見,鎘污染抑制了不同鎘耐性水稻株高的生長,降低其生物量,接種菌株可顯著緩解鎘污染的抑制作用。

圖1 不同處理水稻“特優(yōu)671”、“百香139”的株高和生物量

2.3 假單胞菌TCd-1對鎘污染水稻根系活力和葉片凈光合速率(Pn)的影響

CKB處理“特優(yōu)671”和“百香139”的根系活力分別為0.874、1.196 μg g-1h-1,依次比CK處理提高了9.3%、8.8%；Cd10B處理的根系活力分別為0.779、1.015 μg g-1h-1,依次比Cd10處理提高了3.5%、20.3%(圖2)。CKB處理“特優(yōu)671”和“百香139”的Pn分別為23.1、23.7 μmol m-2s-1,依次比CK處理提高了7.9%、33.1%；Cd10B處理的Pn分別為22.8、17.0 μg g-1h-1,依次比Cd10處理提高了53.0%、63.5%(圖2)。可見,鎘污染降低了水稻的根系活力和Pn,接種菌株顯著提高鎘污染水稻的根系活力和光合作用能力。

圖2 不同處理水稻的根系活力和凈光合速率

2.4 假單胞菌TCd-1對鎘污染水稻葉片葉綠素含量的影響

如圖3所示,CKB處理“特優(yōu)671”的葉綠素a(Chlorophyll a,Chla)、葉綠素b(Chlorophyll b,Chlb)含量及葉綠素a/葉綠素b(Chlorophyll a/Chlorophyll a,Chla/Chlb)分別為2.26 mg/g、3.57 mg/g、0.64,依次比CK處理高48.2%、37.0%和8.2%；Cd10B處理“特優(yōu)671”的Chla、Chlb含量及Chla/Chlb分別為2.23 mg/g、3.34 mg/g、0.67,依次比CK處理高262.1%、224.8%和11.6%。CKB處理“百香139”的Chla、Chlb含量及Chla/Chlb分別為1.53 mg/g、2.79 mg/g、0.55,依次比CK處理高出21.2%、28.6%和-6.2%；Cd10B處理“百香139”的Chla、Chlb含量及Chla/Chlb分別為1.22 mg/g、2.14 mg/g、0.57,依次比CK處理高34.3%、31.8%和2.3%。可見,接種菌株能夠顯著提高水稻的Chla、Chlb含量并調(diào)節(jié)Chla/Chlb,緩解鎘污染對葉片葉綠素的傷害。

圖3 不同處理水稻抽穗期葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素a/葉綠素b

2.5 假單胞菌TCd-1對鎘污染水稻葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響

“特優(yōu)671”和“百香139”葉片的MDA含量均以Cd10處理最高,分別為1.58、1.95 μmol/g,CdB10處理的分別為0.97、1.39 μmol/g,依次比Cd10處理降低了38.5%、28.9%,CKB處理與CK處理間無顯著差異(圖4)。Cd10B處理“特優(yōu)671”葉片的SOD、POD、CAT活性分別比Cd10處理高出7.3%、82.0%、58.8%,CKB處理的POD、CAT活性比CK處理提高了53.8%、36.8%；Cd10B處理“百香139”葉片的SOD、POD、CAT活性分別比Cd10處理高出138.5%、106.2%、172.7%,CKB處理SOD、POD、CAT活性依次比CK處理高出17.8%、12.5%、29.4%(圖4)。可見,Cd10處理顯著降低了水稻葉片的抗氧化能力,增強了膜質(zhì)的過氧化作用,接種菌株表現(xiàn)出顯著的緩解鎘脅迫效應(yīng)。

圖4 不同處理水稻葉片MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性

2.6 假單胞菌TCd-1對抽穗期水稻葉片類黃酮、總酚和含量的影響

圖5 不同處理水稻抽穗期類黃酮含量、總酚含量含量

3 討論

3.1 假單胞菌TCd- 1降低了成熟期水稻的鎘含量

已有研究表明,一些耐重金屬的細(xì)菌可通過細(xì)胞壁吸附、胞外沉淀和螯合、胞內(nèi)累積和轉(zhuǎn)化、以及抗氧化系統(tǒng)等作用,緩解重金屬污染對植物的毒害作用[5]。劉悅暢等[28]在農(nóng)田土壤中添加沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudanonaspalustris)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌液,發(fā)現(xiàn)添加的微生物能夠促進小白菜的生長,其主要作用途徑為添加的菌液降低了土壤中鎘的生物有效性,小白菜對鎘的吸收減少,減輕了鎘毒害；李晴晴等[29]發(fā)現(xiàn)施用解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FH-1菌劑可顯著促進大田種植水稻的生長；陸仲煙等[30]發(fā)現(xiàn)伯克氏菌(Burkholderiasp.D54)能顯著提高10 mg/L鎘處理水稻根的鮮重。趙樹民等[31]發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterum)LY02對鎘和銅污染土壤修復(fù)具有作用,能夠顯著促進黑麥草的生長。本研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌TCd-1可顯著減少不同鎘耐性水稻對鎘的吸收,這與其分離自水稻根際土壤,能夠成功在水稻根際,并且具有極強的鎘耐性及鎘富集能力有關(guān)。同時它是一種具有較強的根際集群能力的植物根際促生菌[17],還可能代謝產(chǎn)生鐵載體、分泌植物抗病物質(zhì)及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等,從而調(diào)解了水稻的生長[14,32—33]。

3.2 假單胞菌TCd-1通過提高水稻根系活力和光合作用促進鎘脅迫水稻的生長

研究表明,鎘污染可破壞葉綠素等光合色素的合成,改變Chla/Chlb,造成PSI、PSⅡ和捕光色素—蛋白質(zhì)復(fù)合體的解體或抑制其光合作用蛋白的形成,從而影響光合作用能量傳遞鏈上的電子傳遞等過程[13]。Cd2+進入植物細(xì)胞后還能取代葉綠體中存在的Fe2+、Zn2+、Mg2+等二價陽離子,并與葉綠體中相應(yīng)的蛋白結(jié)合,如含—SH的蛋白,導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)破壞,抑制葉綠素前體復(fù)合物合成,促進葉綠素降解,降低植物葉綠素含量和光合作用[14]。同時,已有研究表明假單胞菌屬的菌株可分泌鐵載體與重金屬Cd2+、Pb2+和Zn2+等結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物,降低土壤中重金屬的濃度,緩減重金屬對植物根系的毒害作用,促進植株生長[15]。李文華等[34]研究發(fā)現(xiàn),卡伍爾鏈霉菌TJ430(StrptomycescavourensisTJ430)和熒光假單胞菌P32(PseudomonasfluorescensP32)能顯著提高分蘗期水稻的葉綠素含量,降低水稻的鎘含量,有利于水稻生長。本研究表明,接種菌株顯著提高了在鎘污染水稻“特優(yōu)671”和“百香139”的根系活力、Pn、Chla以及Chlb含量,有效地緩解了鎘污染對不同鎘耐性水稻的光合抑制作用。這與菌株能夠改變根際土壤鎘的生物有效性,抑制水稻對鎘的吸收、降低根際土壤的鎘毒性,減少鎘自根系向地上部遷移,進而減輕鎘對葉綠體的破壞,提高葉綠素含量,增強了光合作用有關(guān)。也可能與菌株通過增強次生代謝物(如植物生長素、解毒物質(zhì)等)直接或間接促進根系生長、增強根系活力,促進了葉綠素合成,誘導(dǎo)水稻鎘抗性增強有關(guān)。

3.3 假單胞菌TCd-1通過提高水稻抗氧化系統(tǒng)能力及抗氧物質(zhì)含量,增強了水稻鎘耐性