生物保鮮劑真空浸漬對冰溫貯藏羅非魚蛋白特性的影響

劉 巖，李 敏，金 枝，羅 靜，張 瑩，張乾熙，阮健文，葉 彪，關志強

生物保鮮劑真空浸漬對冰溫貯藏羅非魚蛋白特性的影響

劉 巖1，李 敏1，金 枝2，羅 靜2，張 瑩2，張乾熙1，阮健文1，葉 彪1，關志強1

（1.廣東海洋大學機械與動力工程學院； 2.廣東海洋大學食品科技學院 / 廣東省水產品加工與安全重點實驗室 / 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【目的】通過肌原纖維蛋白生化特性的變化，考察生物保鮮劑結合真空浸漬處理在羅非魚冰溫貯藏中的應用效果。【方法】分別將羅非魚片進行蒸餾水常壓浸漬（對照組）、生物保鮮劑常壓浸漬、生物保鮮劑真空浸漬處理，后測定冰溫保藏過程中肌原纖維蛋白的鹽溶性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量、表面疏水性和羰基含量。【結果】與對照組對比，生物保鮮劑處理常壓浸漬和真空浸漬組冰溫貯藏5 d后的表面疏水性、Ca2+-ATPase酶活性，10 d后的肌動球蛋白的鹽溶性、總巰基含量和羰基含量與對照組出現顯著差異（＜0.05），而VI浸漬和常壓浸漬組之間此時的相應指標對比并無顯著差異（＞0.05）；真空浸漬組在10 d表面疏水性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量，15 d的肌動球蛋白的鹽溶性、20 d羰基含量與常壓浸漬組出現顯著差異（＜0.05）。在貯藏期間，對照組的各肌原纖維蛋白（MP）相關指標變化顯著，VI組各指標在30 d的貯藏時間內變化最平緩。真空浸漬結合生物保鮮劑處理能使冰溫羅非魚的貯藏期延長到30 d。【結論】生物保鮮劑結合真空浸漬預處理工藝能進一步保護肌原纖維蛋白構象的完整性，延緩蛋白質氧化進程，改善羅非魚片在冰溫貨架期的品質。

真空浸漬；生物保鮮劑；冰溫；羅非魚；肌原纖維蛋白

羅非魚（）蛋白質含量高，在貯藏與運輸過程中易受自身內源酶和微生物生長繁殖及氧化作用等影響，導致肌原纖維蛋白（MP）的鹽溶性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量、羰基含量以及表面疏水性等生化特性發生變化，進而影響魚肉的品質和加工性能。

水產品加工預處理時添加保鮮劑并結合低溫貯藏是常用的保鮮方式[1,2]。生物保鮮劑因其安全、無毒、可食用的特點被廣泛關注，國內外學者也針對生物保鮮劑和冰溫貯藏技術對蛋白質功能特性的保護作用進行了探討[3-5]。但是上述研究在水產品蛋白質特性變化方面并不完整，目前尚未見有系統研究蛋白質特性的報道。

真空浸漬技術（Vacuum Impregnation，VI）能夠影響食品的多孔結構，加速食品基質和浸漬溶液之間的雙向傳質，從而提高食品浸漬效果和加工效率[6]，目前普遍應用于肉類腌制[7-9]和果蔬加工貯藏[10-14]。近年來僅有極少量將VI應用于水產品貯藏的研究，其中Zhao等[6]研究發現，魚膠和葡萄籽提取物聯合VI有效改善魚片的新鮮度和安全性。ShiekhKhursheed等[15]采用云樹葉提取物，結合脈沖電場和VI，有效延長凡納濱對蝦（）的貨架期。目前生物保鮮劑結合真空浸漬處理方面的研究主要集中在產品的新鮮度，對蛋白質的功能特性綜合研究尚未見報道。

本課題組前期對冰溫羅非魚生物保鮮劑進行研究[16]，獲得復合生鮮劑的最佳配比為：海藻酸鈉質量濃度為8 g/L，Nisin質量濃度為0.8 g/L，異抗壞血酸鈉質量濃度7.5 g/L，經該生物保鮮劑處理后的羅非魚可將其冰溫（-2℃）貨架期由15 d延長至22 d。結合前期研究，本研究擬通過VI輔助生物保鮮劑預處理對生態冰溫貯藏期間羅非魚MP生化特性變化影響的探討，了解真空浸漬水產品冰溫貨架期的優勢，以期為該技術的推廣應用提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

材料：羅非魚，購于廣東省湛江市湖光市場。

試劑：海藻酸鈉，源葉生物有限公司；Nisin，萬利達生物科技有限公司；異抗壞血酸鈉（異VC鈉），廣州利源食品添加劑有限公司；Ca2+-ATPpase活性測試盒、蛋白質定量測試盒（考馬斯亮藍法）、總巰基測定試劑盒、羰基含量測試盒，南京建成生物工程研究所；溴酚藍，天津市化學試劑研究所。

1.2 主要儀器與設備

真空包裝機 DZ400/2D（瑞利包裝機械有限公司）；紫外分光光度計UV-8000A（上海元析儀器有限公司）；真空預冷實驗機VCD-02（上海鮮綠真空保鮮設備有限公司）。

1.3 實驗設計與方法

1.3.1 樣品處理 將活魚宰殺，除去頭、尾、表皮及內臟，修整成規格為12 cm×5 cm×1 cm、質量為（80±2）g的魚片。將魚片隨機分成3組：A組魚片使用無菌蒸餾水常壓浸漬27 min（對照組）；B組魚片使用生物保鮮劑常壓浸漬27 min（常壓浸漬組）；C組魚片采用生物保鮮劑真空浸漬處理（真空浸漬組，VI組），真空壓力為0.06 MPa，真空浸漬時間為15 min，常壓恢復時間為12 min。3組魚片浸漬處理結束后取出瀝干，真空包裝存放于-2 ℃環境中貯藏，每5 d對魚片進行相關蛋白指標測定。

1.3.2 肌動球蛋白的提取 參照Zhou等[17]的方法測定。準確稱取絞碎的2 g羅非魚肉于燒杯中，隨后加入20 mL已預冷的提取試劑KCl溶液（0.6 mol/L，pH 7.0），在冰浴條件下對魚肉進行2 min均質分散，為防止過熱，每均質10 s停10 s。均質結束后溶液進行冷卻離心（4 ℃、10 000 r/min，30 min），離心完成后收集上清液。向上清液加入3倍體積已預冷的蒸餾水，并繼續按該條件（4 ℃、10 000 r/min）離心20 min。離心結束后保留沉淀，然后向沉淀中加入已預冷20 mL KCl溶液（0.6 mol/L，pH 7.0），置于4 ℃環境中30 min。最后在4 ℃、10 000 r/min的條件下離心20 min，離心后收集的上清液即為肌動球蛋白溶液。

1.3.3 鹽溶性的測定 參照南京建成蛋白定量測試盒（考馬斯亮藍法）說明書進行測定。

1.3.4 Ca2+-ATPase活性的測定 參照南京建成公司的ATP酶測試盒說明書進行測定。

1.3.5 總巰基含量的測定 參照南京建成公司蛋白質巰基含量測試盒指導方法進行。

1.3.6 羰基含量測定 參照南京建成公司蛋白質羰基含量測試盒指導方法進行。

1.3.7 表面疏水性的測定 參照Chelh等[18]的方法進行。使用20 mmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液將蛋白樣液的質量濃度調整為5 mg/mL，取2 mL蛋白樣液和40 μL 1 mg/mL溴酚藍（BPB）試劑于離心管中，充分振蕩混勻后室溫靜置10 min。然后在4 ℃、4 000 r/min條件下冷卻離心15 min，取上清液并稀釋10倍后595 nm處測定光密度值。把加入40 μL 1 mg/mL BPB試劑的2 mL磷酸鹽緩沖液作為空白對照組，使用磷酸鹽緩沖液進行調零。將結合態BPB（μg）作為表面疏水性指數，按照下列公式計算：

溴酚藍結合量 = 200×（空白-樣品）/空白，

式中，空白是磷酸鹽緩沖液加入BPB試劑后在595 nm處的光密度值；樣品表示蛋白樣液加入BPB試劑后在595 nm處的光密度值。

1.4 數據處理

采用Excel 2007進行數據記錄和整理，用SPSS18.0軟件進行統計分析，設置顯著水平為＜0.05，使用Origin8.0作圖。實驗結果均為3次平行實驗平均值。對照組在貯藏20 d、常壓浸漬組在貯藏25 d后外觀已經開始腐敗，無參數測量的意義。

2 結果與分析

2.1 羅非魚片貯藏期間蛋白鹽溶性的變化

從圖1可知，隨著貯藏時間延長，三組魚片的肌動球蛋白鹽溶性蛋白含量逐漸下降，說明貯藏過程中肌動球蛋白的構象發生改變導致鹽溶性受到影響[19]。VI組下降幅度最小，對照組在貯藏過程中差異顯著（< 0.05）。貯藏5 d，三組的肌動球蛋白鹽溶性間沒有顯著差異（> 0.05），但與0 d相比，對照組開始出現顯著差異，而常壓浸漬組和VI組變化不明顯。貯藏10 d，對照組開始與常壓浸漬組和VI組出現顯著差異（< 0.05），此時與0 d和5 d相比常壓浸漬組和VI組鹽溶性顯著降低，但組間沒有差異。這表明生物保鮮劑可以起到抑制肌動球蛋白變性的作用。魚肉在冰溫貯藏過程中由于微生物大量繁殖使得內部微環境改變，導致不溶性大分子量蛋白質聚集體的形成，從而引起蛋白質溶解性降低[20]。且貯藏時間的累加會造成蛋白質的逐漸變性，分子間疏水性殘基相互交聯形成不溶性聚集體，蛋白質鹽溶性也會下降[21]。VI組和常壓浸漬組魚片鹽溶性下降幅度遠低于對照組，可能是生物保鮮劑中的海藻酸鈉、異VC鈉有較好的抗氧化性，阻礙蛋白質氧化變性進程，減慢蛋白質鹽溶性的下降速率，這一點與郭利芳等[5]和郭芳等[3]的研究結論一致。貯藏15 d，常壓浸漬組的鹽溶性開始顯著低于VI組（＜0.05）。隨著時間的推移，貯藏20 d與0 d相比，VI組、常壓浸漬組和對照組的下降幅度分別為41.49%、45.15%和68.8%，而且VI組在30 d的蛋白鹽溶性含量仍在可接受范圍內，說明VI處理效果優于常壓浸漬處理。這可能是因為真空狀態和恢復常壓之間的壓力差，改變了魚肉肌間的間隙分布[7]，促使保鮮劑更有效地滲透到魚肉內部，增強其抑制蛋白變性的效果。

凡含一個相同字母表示差異不具統計學意義（P > 0.05）；小寫字母表示同樣處理方式不同貯藏時間，大寫字母表示相同貯藏時間不同處理

2.2 羅非魚片貯藏期間Ca2+-ATPase活性的變化

如2所示，三組羅非魚片在冰溫貯藏過程中Ca2+-ATPase活性呈現下降趨勢。因為魚肉在低溫貯藏過程中發生pH下降、微生物繁殖、脂肪氧化等變化會破壞蛋白質相對的穩定體系，從而引起肌球蛋白頭部區域的構象發生改變，Ca2+不能將變性的肌球蛋白頭部的ATP點位激活，導致Ca2+-ATPase活性下降[22]。但三組羅非魚片在冰溫貯藏過程中Ca2+-ATPase活性下降速度并不相同。相同貯藏時間點，常壓浸漬組和VI組魚片的Ca2+-ATPase活性下降速度均低于對照組，其中VI組下降速度最小。從10 d開始，對照組魚片Ca2+-ATPase活性均顯著低于同貯藏時間的常壓浸漬組和VI組（＜0.05），這與劉鋒等[4]的研究結論一致，說明生物保鮮劑可以在一定程度上保護肌球蛋白的完整性，有效抑制Ca2+-ATPase的活性下降。

VI組在貯藏期間，Ca2+-ATPase活性下降平緩，10 ～ 20 d之間下降不顯著（> 0.05）。20 d時與0 d相比，對照組、常壓浸漬組和VI組活性分別下降了72.15%、51.19%和39.82%，VI組在30 d時與25 d相比Ca2+-ATPase活性變化不顯著（＞0.05），且比常壓浸漬組25 d的含量還高。綜合來看，VI組的保鮮效果最好。這是因為肌肉中的大部分水分是由毛細血管力控制的，而毛細血管力分布在MP內部各類蛋白絲排列中，VI作用使蛋白絲之間的間隙增大，有利于保鮮劑進入蛋白絲內部，而保鮮劑進一步改變了蛋白絲上的電荷數量，導致蛋白絲之間的空間發生排斥并進一步擴大[23]，從而使更多的保鮮劑進入內部，使肌動球蛋白分子的球狀頭部結構的破壞程度小于常壓浸漬組，因此VI處理的魚片保鮮效果優于常壓浸漬處理。

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2.3 羅非魚片貯藏期間總巰基含量的變化

三組魚片冰溫貯藏期間總巰基含量的變化見圖3。隨著貯藏的進行，各組魚片的總巰基含量趨勢線在10 d前均呈陡降形式，而在10 d后趨勢線變得相對平緩，其中對照組下降程度最劇烈，在整個貯藏過程中均下降顯著（＜0.05）；10 d時，對照組、常壓浸漬組和VI組間含量差異顯著（＜0.05）。貯藏20 d，對照組、常壓浸漬組和VI組總巰基質量摩爾濃度分別下降76.63%、58.85%，52.76%，此時對照組魚片已開始出現腐敗跡象，常壓浸漬組和VI組狀態尚可。在25 d，常壓浸漬組與VI組出現顯著差異（＜0.05），25 d之后常壓浸漬組開始出現腐敗跡象，而VI組狀態尚可。在整個過程中VI組總巰基下降更緩慢，尤其在15 d以后，趨勢線比其他兩組更平緩，說明VI處理增強了保鮮效果。

巰基基團對于維持MP空間結構穩定起著非常重要的作用[24]，由于活性酶參與氧化、冰晶對蛋白質結構的破壞等原因[25]導致低溫貯藏過程中處于魚肉MP的活性巰基暴露出來，被自由基氧化形成二硫鍵—S—S—[26,27]，肌球蛋白的球狀頭部上的巰基發生氧化使肌球蛋白聚集同時會引起Ca2+-ATPase活性下降[4]，因此本研究中巰基的含量變化與Ca2+-ATPase活性下降情況總體保持一致。上述結果表明，生物保鮮劑的強抗氧化能力，能夠抑制MP變性，減少二硫鍵—S—S—的交聯和肌球蛋白的聚集，減緩魚片巰基的氧化程度，減慢魚片貯藏品質劣變進程。同時，施加真空使魚片肌肉纖維膨脹，肌肉組織內部氣體和部分液體被消除，使接觸面積增大，恢復大氣壓時，溶液更容易進入孔隙，這就是VI作用帶來的壓力梯度變化和毛細管效應，即水動力機制[28]，其增強了保鮮劑在魚片組織結構中的滲透。VI組的總巰基含量在30 d時與25 d相比變化不顯著，而且與25 d的真空浸漬組數值接近。

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2.4 羅非魚片貯藏期間表面疏水性的變化

圖4通過溴酚藍結合量反映表面疏水性的大小[26]，可以看出在冰溫貯藏過程中，三組魚片的疏水性均呈上升趨勢。對照組的趨勢線上升最快，遠高于其他兩組，說明未經保鮮劑處理的樣品表面疏水性變化很快。這可能是因為生物保鮮劑促進蛋白質與外部水分子之間的締合作用，疏水性基團暴露得較少[29]，溴酚藍與疏水位點結合的可能性減小，因而保鮮劑處理的各組魚片溴酚藍結合量較低。

整個貯藏過程中，對照組的表面疏水性顯著升高（< 0.05）。貯藏前10 d，常壓浸漬組與VI組的溴酚藍結合量上升趨勢較為平緩，貯藏10 d之后溴酚藍結合量加快，趨勢線變陡。在貯藏末期，對照組、常壓浸漬組和VI組溴酚藍結合量與初始值相比分別增大了4.58倍、3.22倍和2.17倍，說明貯藏過程中魚片的MP發生嚴重的變性而引起構象改變，內部巰基組分的外露導致二硫鍵—S—S—被進一步氧化，產生大量的非二硫鍵和二硫鍵交聯，蛋白基團不斷聚合，進一步加劇了疏水基團的增長[30]，最終導致MP發生不可逆的變性[31]。

VI組的疏水性趨勢線較為平緩，VI組30 d的疏水性與25 d相比差別不顯著（＞0.05），與常壓浸漬組20 d的數值近似。這是因為VI預處理產生的水動力機制還伴隨著變形弛豫現象，不僅影響系統的動力和平衡狀態，而且影響食品組織的物理、機械和微觀結構特性[28]，進一步促進了生物保鮮劑在魚片蛋白絲之間的傳遞，有效保護MP構象的完整性，抑制疏水基團的增長。

2.5 羅非魚片貯藏期間羰基含量的變化

圖5可知，在冰溫貯藏過程中各組羅非魚片羰基含量呈上升趨勢，是因為MP分子中的氨基酸側鏈被氧化、還原糖發生非酶糖化應、非蛋白糖基化合物結合和多肽鏈的氧化斷裂[32-34]等多種因素導致羰基的不斷產生。對照組羰基含量始終高于常壓浸漬組和VI組，說明未經任何處理的魚片MP氧化進程很快。其中常壓浸漬組在5 d之后、VI組在15 d之后趨勢線才變陡，VI組和常壓浸漬組之間在20 d才開始出現顯著差異（< 0.05）。這表明生物保鮮劑可顯著延緩MP的氧化進程，生物保鮮劑中的活性成分具有很好的抗菌作用[16]，能夠抑制氨基酸側鏈的氧化，一定程度上抑制肽鏈的氧化斷裂。

VI組魚片羰基含量增加緩慢，在30 d時，其羰基含量與25 d差異不大，均小于常壓浸漬組20 d的含量。這是因為VI預處理可以使外部溶液通過的孔隙以快速、可控、均勻的方式直接進入食品組織內部，而不破壞原有的結構[23]，一方面使保鮮劑在魚片表面形成保護薄膜，另一方面能通過制造真空狀態而改善肌肉內部孔隙結構、真空-恢復常壓帶來的壓力變化而產生的震動進一步增強了的水動力滲透機制[7]，使生物保鮮劑更好地滲透到魚片內部，增強保鮮效果，因而VI處理組魚肉氧化變性程度最低。

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3 結論

1）冰溫貯藏過程中，經生物保鮮劑處理的魚片MP各生化指標變化幅度均低于對照組，其中及以后的蛋白鹽溶性、總巰基含量和羰基含量在貯藏10 d開始、Ca2+-ATPase活性和表面疏水性在貯藏5 d開始與對照組有顯著差異（＜0.05），表明生物保鮮劑能有效保護羅非魚片MP構象的完整性，延緩魚肉腐敗變質進程。

2）相比常壓浸漬組，VI組的魚片MP變性程度更低。VI組羅非魚片冰溫貯藏25 ～ 30 d時各MP指標差異不大（＞0.05），其中羰基、總巰基含量低于常壓浸漬組20 d時的含量，表面疏水性與常壓浸漬組20 d數值接近，蛋白鹽溶性和Ca2+-ATPase活性高于常壓浸漬組25 d，使VI組保質期延長到30 d，比單獨使用生物保鮮劑增加8 d，說明VI預處理能使生物保鮮劑有效地滲入到魚片內部，使得生物保鮮劑抑制MP變性的作用增強，有效延長延長冰溫羅非魚貯藏期。

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Effect of Vacuum Impregnation Assisted Biological Preservatives on the Protein Properties of Tilapia Fillets During Ice-Temperature Storage

LIU Yan1, LI Min1, JIN Zhi2, LUO Jing2, ZHANG Ying2,ZHANG Qian-xi1, RUAN Jian-wen1, YE Biao1, GUAN zhi-qiang1

（1.; 2.,,,,,524088,）

【Objective】To evaluate the biochemical characteristics of myofibrillar protein and ice-storage shelf life of tilapia fillets after treatment of a preservatives add a vacuum impregnation process.【Method】 Tilapia fillets were treated with compound preservatives combined with vacuum impregnation and compound preservatives at atmosphere pressure, and compared with the control group.The salt solubility of actin, Ca2+-ATPase enzyme activity, total sulfhydryl content, surface hydrophobicity and carbonyl content were determined.【Results】Compared with the control group, biological preservative treatment group in atmosphere pressure impregnation and vacuum impregnation at ice temperature storage, the surface hydrophobicity and Ca2+-ATPase enzyme activity after 5 d, the salt solubility of actomyosin, content of total sulfhydryl content and carbonyl group after 10 d, were significantly different from the control group (< 0.05).However, there was no significant difference (> 0.05) in the corresponding indicators at the above time between the vacuum impregnation and atmosphere impregnation groups.There was a significant differences(< 0.05) between the vacuum impregnation and atmosphere impregnation in the surface hydrophobicity, Ca2+-ATPase activity, and total sulfhydryl content of 10 d, the salt solubility of actomyosin of 15 d, the carbonyl content of 20 d.During the storage period, the MP-related indicators of the control group have been showing significant changes.However, the change curve of the VI impregnation group is steady.Vacuum impregnation combined with biological preservative treatment can prolong the storage period of ice-temperature tilapia for 30 days.【Conclusion】Biological preservation combined with the vacuum immersion pretreatment process can further protect the conformational integrity of myofibril protein, delay the protein oxidation process, improve the shelf-life and quality of tilapia fillets at ice temperature.

vacuum impregnate; biological preservatives; ice temperature; tilapia; myofibril protein

TS254.4

A

1673-9159（2022）02-0088-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.011

2021-11-22

廣東省自然科學基金（2015A030313613），湛江市科技計劃項目（2019A01043）

劉巖（1979―），女，講師，碩士，研究方向為食品冷凍冷藏工藝與制冷技術。E-mail：liuyanz@163.com

李敏（(1967―)，女，教授，碩士，研究方向為食品冷藏與制冷熱泵應用技術。E-mail：E-mail:limin2080@163.com

劉巖，李敏，金枝，等.生物保鮮劑真空浸漬對冰溫貯藏羅非魚蛋白特性的影響[J].廣東海洋大學學報，2022，42（2）：88-94.

（責任編輯：劉朏）