金屬離子及酚酸添加對模擬葡萄酒溶液輔色作用的影響

吳娟弟，張波*，韓麗婷，楊博，王瑩捷，韓舜愈，陳建軍，張軍強，張竹林

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄與葡萄酒產業技術研發中心，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅張掖國風葡萄酒業有限責任公司，甘肅 張掖，734000)

顏色是紅葡萄酒主要的感官特征之一，是葡萄酒質量控制的關鍵參數，影響著產品的品質和消費者的評價[1]。花色苷作為紅葡萄酒顏色的重要物質基礎，其含量和組成直接影響著紅葡萄酒的色澤特點及顏色穩定性[2]。然而花色苷不穩定，易受多種因素影響(溫度、光線、pH、溶劑和氧化劑等)，從而使紅葡萄酒的顏色發生改變甚至失色，進而影響其質量[3]。研究發現，輔色作用作為一種綠色、自然、安全的食品增色方法，不僅可對新鮮紅葡萄酒顏色有積極影響，對陳年葡萄酒的色澤也有一定貢獻[4]。因此，輔色作用越來越多地被科研人員關注，目前已成為葡萄酒化學領域研究的熱點[5-7]。

常見的輔色作用可分為分子內輔色、分子間輔色和自聚合作用。此外，葡萄酒中存在的一些金屬離子也可與部分花色苷通過絡合形式來穩定葡萄酒的顏色(金屬離子輔色)[8]。多見報道的金屬離子有Sn2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Al3+、Mg2+和K+等[9]。CZIBULYA等[6]研究發現，在紅葡萄酒中添加K+和Ca2+可提高其顏色的熱穩定性，且K+還可以提高溶液體系的顏色強度。而利用不同金屬離子處理刺葡萄皮色素溶液后發現，Ca2+、Zn2+、Al3+和Fe3+等產生的作用效果存在明顯的不同，其中Ca2+、Zn2+和Al3+等的輔色效果隨離子濃度的升高逐漸增強，而Fe3+則會使色素溶液產生黑褐色沉淀，失去花色苷的特性[10-11]。

輔色效果不僅與參與的輔色因子種類有關，也受反應溶液基質效應的影響，例如溶液pH、乙醇含量、反應體系溫度[8]、以及其他基質物質[12]等。與僅添加羥基肉桂酸的處理相比，Al3+的添加會使其與花色苷之間的相互作用增強，使色素溶液呈現更明顯的藍-紫色色澤[13]。Al3+和Fe3+不僅可使紫薯花色苷提取液在近中性的條件下(pH=6.0～8.5)呈現藍-紫色特征，還可減緩體系中因咖啡酸氧化造成的色素降解[14]。此外，有研究發現，在花色苷溶液中添加Fe2+可增加鞣花酸與花色苷配合物的穩定性，但其三價態結構(Fe3+)卻可與鞣花酸形成配合物，從而導致鞣花酸的輔色效果降低[15]。

雖然目前對葡萄酒輔色作用的研究已有一定數量的報道，但多數文獻集中在酚類輔色物質方面，對涉及金屬離子的輔色研究目前還很有限[7-8]，特別是有關金屬離子和酚類物質共同參與的輔色反應更是鮮有報道。考慮到真實葡萄酒溶液中基質物質的復雜性，本試驗擬采用紫外-可見分光光度法和CIELab顏色空間法，測定和分析K+、Mg2+和Al3+等葡萄酒中常見金屬元素在不同濃度及不同酚酸(香草酸和原兒茶酸)條件下的輔色效果，以期為金屬輔色化作用在葡萄酒顏色品質方面的研究提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

花青素-3-O-葡萄糖苷(葡萄酒中常見的單體花色苷及自然界中最主要的花色苷之一，純度≥95%)，上海源葉生物科技有限公司；氯化鉀(純度≥99.99%)、氯化鎂六水合物(純度99.99%)、氯化鋁六水合物(純度99%)，上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉、酒石酸(分析純)，天津市光復科技發展有限公司；氫氧化鈉(分析純)、無水乙醇(色譜純)，煙臺市雙雙化工有限公司。

T9CS 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-3E pH計，上海雷磁有限責任公司；DKT-100干式恒溫器，杭州米歐儀器有限公司；渦旋混合/振蕩器，美國Scientific Industries公司；F-100S 超聲波清洗機，深圳福洋科技集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 模擬葡萄酒溶液配制

模擬葡萄酒溶液：酒石酸(5 g/L)，12%vol乙醇，加入氯化鈉調整離子強度至0.2 mol/L，用強酸強堿調整pH為3.6，置于容量瓶保存備用[16]。

1.2.2 不同金屬離子對花色苷顏色的影響

準確稱取花青素-3-O-葡萄糖苷0.009 7 g于100 mL容量瓶，并用上述配制的模擬葡萄酒溶液進行溶解定容，使其濃度為0.2 mmol/L。用同樣的方法溶解輔色素氯化鉀、氯化鎂、氯化鋁(濃度均為0.2、1.0、10.0、20.0 mmol/L)，與花色苷溶液各1 mL等體積混合，得到花色苷/輔色素摩爾濃度比為1∶0、1∶1、1∶5、1∶50、1∶100 的模擬酒溶液。將混合液置在恒溫器中20 ℃下避光反應30 min后測定，以純凈水作為空白。

1.2.3 添加酚酸對不同金屬離子輔色的影響

不同濃度酚酸溶液配制：用配制的模擬葡萄酒溶液(100 mL)溶解花青素-3-O-葡萄糖苷(0.013 6 g)，使其濃度為0.3 mmol/L，使用同樣的方法對3種金屬離子輔色素和香草酸及原兒茶酸進行溶解(0.3、1.5、7.5、15、30 mmol/L)，使用花色苷、金屬離子、酚酸溶液各1 mL加入離心管，配制成花色苷/酚酸/金屬離子摩爾比為1∶0∶0、1∶25∶0、1∶25∶1、1∶25∶5、1∶25∶50、1∶25∶100的模擬葡萄酒溶液，將混合液置于恒溫器中20 ℃下避光反應30 min后測定，以純凈水作為空白。

同理，按照上述方法配制花色苷/金屬離子/酚酸摩爾比為1∶0∶0、1∶25∶0、1∶25∶1、1∶25∶5、1∶25∶50、1∶25∶100 的模擬酒溶液，將混合液置于恒溫器中20 ℃ 下避光反應30 min后測定，以純凈水作為空白。

1.3 輔色效應的測定

通過比較最大吸收波長下吸光值增加的百分比M以及最大吸光值對應的波長λmax的偏移估計輔色作用產生的增色效應(M)和紅移效應(Δλ)[17],如公式(1)、公式(2)所示。

(1)

Δλ=λ-λmax

(2)

式中：A、A0分別為515 nm處添加輔色素的模擬酒溶液與對照組吸光度值；λ為偏移后的最大吸收波長。

1.4 CIELab顏色評估

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

1.5 數據統計分析

采用Microsoft Office Excel 2010 進行數據處理，Origin 2018繪圖，IBM SPSS Statistics 25對數據進行方差分析，利用Duncan’s多重比較在置信區0.05下對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 K+、Mg2+和Al3+等金屬離子的輔色效果

2.1.1 金屬離子對模擬葡萄酒輔色作用的影響

一般來說，輔色作用的特征主要是增色(M)和(或)紅移(Δλ)變化[4]。由表1數據可知，隨著金屬離子溶度的增加，模擬葡萄酒溶液表現出明顯的增色變化，其中Al3+的作用效果最強(M=3.48%～23.24%)，其次為Mg2+(M=0.86%～8.58%)，而K+的效果相對較弱(M=0.09%～0.12%)。特別是在摩爾比為1∶100時，Al3+的增色強度是初始時(1∶1，摩爾濃度比，下同)的6.68倍，相比同濃度的K+和Mg2+，較后者高出99.48%和63.08%，呈現Al3+>Mg2+>K+的趨勢，表現出較高價態的金屬輔色因子可能具有較好作用效果的現象。這一結果與LI等[18]的研究發現相似，推測可能與高價態金屬離子易與花色苷B環上的游離羥基結合有關[19]。而比較添加處理產生的紅移量發現，Al3+處理可使模擬葡萄酒溶液產生明顯的紅移變化(Δλ=3～7 nm)，而K+和Mg2+處理后卻未表現出紅移現象(Δλ=0 nm)，這也在一定程度上進一步印證了上述結果所表現出的輔色效果趨勢。

表1 金屬離子對模擬葡萄酒增色(M)和紅移效應(Δλ)的影響Table 1 The hyperchromic effect (M) and bathochromic shift (Δλ) of different metal ions on simulated wine solution

2.1.2 金屬離子對模擬葡萄酒CIELab顏色參數的影響

為更全面地了解供試金屬離子的輔色作用與模擬葡萄酒顏色間的變化關系，對其由量變(ΔL+ΔC)和質變(ΔH)因素所引起的色差(ΔE)貢獻情況進行分析。結果顯示(圖1)，K+、Mg2+和Al3+處理所造成的ΔE變化主要與量變因素有關(ΔL+ΔC=73.61～99.77)，而質變因素貢獻較小(ΔH=0.23%～26.81%)。同時，比較不同濃度處理的樣品發現，當金屬離子的添加濃度較低時(<1∶5)，色度變化(ΔC)在量變因素中的作用較高(>60.00%)，但隨著金屬離子添加濃度的增加，由于色調變化(ΔH)的逐漸增強，特別是Al3+處理，使得ΔH所占比例相應提高，導致質變對色差的貢獻由初始的3.68%升高至26.81%。

表2 金屬離子對模擬葡萄酒CIELab參數的影響Table 2 The effect of different metal ions on CIELab parameters of simulated wine solution

a-K+；b-Mg2+；c-Al3+圖1 金屬離子對模擬葡萄酒ΔE的影響Fig.1 The effect of different metal ions on ΔE of simulated wine solution

2.2 酚酸添加對K+、Mg2+和Al3+等金屬離子輔色作用的影響

2.2.1 酚酸添加對含金屬離子模擬葡萄酒輔色作用的影響

酚類物質是葡萄酒溶液中常見輔色因子，同時也是酒中重要的基質組分[8]。因此在上文試驗的基礎上，通過在模擬體系中添加固定濃度的酚酸(香草酸和原兒茶酸，其與花色苷的摩爾濃度比為1∶25)，以此來初步研究基質中酚類成分對金屬離子輔色效果的影響。比較表1和表3數據可知，對于含Al3+和K+的模擬葡萄酒溶液來說，酚酸的加入可使原溶液的輔色效果進一步增強(4.26%～10.70%和0.87%～27.85%)。而比較不同結構的酚酸發現，香草酸和原兒茶酸所產生的效果有所區別。對于含Al3+和K+的溶液來說，香草酸所產生的增色和紅移效果較同濃度的原兒茶酸高6.38%～65.01%和30.00%～66.67%。研究發現，酚酸化合物結構中的取代基團種類和數量會影響其輔色能力的大小，當酚環中羥基被甲氧基取代時，相同類型酚酸的輔色作用效果會明顯提高[20-21]。因此，比較香草酸(3-甲氧基-4-羥基苯甲酸)和原兒茶酸(3, 4-二羥基苯甲酸)的化學結構可知，香草酸的輔色能力要強于后者，這同樣也解釋了本試驗所觀察到的結果。

與Al3+和K+的表現相異，試驗發現在含Mg2+的模擬葡萄酒溶液中加入酚酸后，并未產生類似前者的現象。相反，當Mg2+添加量<1∶50時，酚酸處理可使模擬葡萄酒的吸光值下降11.04%～22.19%，呈現出一定程度的“減色效應”(即反輔色作用)[22]。不過值得注意的是，當Mg2+濃度升至1∶100時，其溶液的吸光值會出現一定的回復現象(14.32%)。BOULTON[4]研究認為，在復雜的溶液體系中，輔色現象是體系中各類輔色因子競爭平衡的結果。各輔色因子的濃度高低，以及與花色苷結合能力的強弱將決定反應體系最終的輔色效果和觀察到的顏色特征。例如，在含花色苷-輔色因子的溶液體系中加入葡萄籽粗體物，會破壞已建立的輔色平衡，造成溶液體系光吸收值的降低，產生“反輔色作用”[20]。比較本試驗中Mg2+和酚酸處理，我們認為，酚酸的加入可能會破壞原本由Mg2+和花色苷所建立的輔色體系(推測酚酸與Mg2+可能會產生結合)，導致溶液體系增色效果的喪失。但當Mg2+濃度超過一定數量后(即酚酸與Mg2+的結合達到飽和)，剩余的Mg2+會繼續與花色苷反應，再次產生溶液吸光值的增加。不過相關的機制原因還需做進一步的研究。

表3 酚酸添加對含金屬離子模擬葡萄酒增色(M)和紅移效應(Δλ)的影響Table 3 The hyperchromic effect (M) and bathochromic shift (Δλ) of different phenolic acids on the pigment/metal ion simulated wine solution

2.2.2 酚酸添加對含金屬離子模擬葡萄酒CIELab顏色參數的影響

分析圖2可知，添加酚酸并未改變金屬離子輔色所造成的顏色貢獻效果，仍然表現為量變因素(ΔL%+ΔC%>80%)大于質變因素(ΔH%<20%)的特征，但在程度上有所差別。例如，酚酸處理使ΔL%的反應效果由僅加入金屬離子時的2.24%～33.59%，變化為酚酸和金屬離子共同作用時的7.87%～26.62%。此外，不同的金屬離子與酚類組合產生的效果也不相同，例如與僅添加Al3+的模擬葡萄酒體系相比，Al3+與香草酸共同處理的樣品，其量變因素對ΔE的貢獻較前者增加了1.86%～13.56%。而Al3+與原兒茶酸共同處理的溶液，卻表現出在低濃度時(花色苷/酚酸/金屬離子≤1∶25∶5)量變因素降低(較單獨使用Al3+的溶液降低10.34%～14.15%)，在高濃度時量變效果增加(較單獨使用Al3+的溶液提高8.48%～9.73%)的現象。但是對于Mg2+處理，添加酚酸將減弱量變對色差的作用效果(香草酸和原兒茶酸添加分別造成0.59%～2.03%和0.23%～3.59%的下降)。

表4 酚酸添加對含金屬離子模擬葡萄酒CIELab顏色參數的影響Table 4 The effect of different phenolic acids on CIELab parameters of the pigment/metal ion simulated wine solution

2.2.3 酚酸濃度對含金屬離子模擬葡萄酒輔色作用的影響

為了明確酚酸在不同濃度水平下的作用，試驗在固定金屬離子添加比例的基礎上(金屬離子與花色苷的摩爾濃度比為1∶25)繼續做進一步的研究。由表5試驗結果可知，隨著酚酸濃度的增加，含Al3+模擬葡萄酒溶液所產生的增色效果逐漸增強(M=9.78%～53.99%)(P<0.05)。但是對含K+和Mg2+的模擬酒溶液，其光吸收值卻表現出先降低后升高的變化趨勢，這使得酚酸添加量在≤1∶25∶5(花色苷/金屬離子/酚酸)時將出現減色現象，特別當濃度為1∶25∶1時，與僅添加金屬離子的樣品(花色苷/金屬離子/酚酸摩爾濃度比1∶25∶0)相比，前者的吸光度分別降低1.48%(香草酸/K+)和4.35%(香草酸/Mg2+)，0.72%(原兒茶酸/K+)和5.44%(原兒茶酸/Mg2+)。此外，隨著酚酸濃度的逐步升高，各樣品的紅移量也逐漸增大(Δλ=1～10 nm)，并在最高添加濃度時效果最強，這與先前的研究相似[8]。

a-K+添加香草酸；b-Mg2+添加香草酸；c-Al3+添加香草酸；d-K+添加原兒茶酸；e-Mg2+添加原兒茶酸；f-Al3+添加原兒茶酸圖2 酚酸添加對含金屬離子模擬葡萄酒ΔE的影響Fig.2 The effect of different phenolic acids on ΔE of the pigment/metal ion simulated wine solution

表5 不同酚酸濃度對含金屬離子模擬葡萄酒增色(M)和紅移效應(Δλ)的影響Table 5 The hyperchromic effect (M) and bathochromic shift (Δλ) of different phenolic acid concentrations on the pigment/metal ion simulated wine solution

2.2.4 酚酸濃度對含金屬離子模擬葡萄酒CIELab顏色參數的影響

分析表6數據可知，相比于未添加任何輔色因子的模擬葡萄酒樣品(花色苷/金屬離子/酚酸摩爾濃度比1∶0∶0)而言，在含Al3+的模擬酒中改變酚酸的添加濃度，將使其L*和b*值降低(分別降低了1.43～4.26 a.u.和1.28～1.98 a.u.，P<0.05)，a*值增加(1.53～7.37%)。但是對于含Mg2+和K+的樣品卻只有在酚酸濃度>1∶25∶5(花色苷/金屬離子/酚酸)時才能產生類似的效果(L*值和b*值降低0.57～2.51 a.u.和0.22～0.51 a.u.，a*值增加1.49～6.16 a.u.)。同時，與前述的結果相似，添加香草酸的溶液仍表現出較好的效果。例如，與添加原兒茶酸的金屬輔色溶液相比，香草酸處理樣品的顏色呈現出更深的紅-紫色狀態(其L*和b*值較原兒茶酸樣品分別降低了1.51%和6.73%，a*值升高了12.86%)。

表6 不同酚酸濃度對含金屬離子模擬葡萄酒CIELab顏色參數的影響Table 6 The effect of different phenolic acid concentrations on CIELab parameters of the pigment/metal ion simulated wine solution

由圖3可知，隨酚酸濃度的增加，金屬離子處理的模擬葡萄酒顏色差別仍然以量變為主(ΔL+ΔC=67.28%～99.76%)，但不同金屬離子和不同酚酸添加所形成的效果有所區別，其中隨酚酸濃度升高(花色苷/金屬離子/酚酸摩爾濃度比1∶25∶1～1∶25∶100)，K+和Al3+處理的量變作用逐漸增強(分別提高10.21%和30.31%，P<0.05)，而Mg2+處理樣品的量變貢獻卻變化有限(≤1.50%)。

3 討論

葡萄酒中一些金屬離子作為其基本組成成分，可通過絡合作用與部分花色苷結合，從而起到穩定和保護葡萄酒顏色的作用[7]。研究表明，與二價離子Mg2+相比，Fe3+、Ga3+和Al3+等三價金屬離子對花色苷的光譜特性和顏色特征的影響更加明顯，并且隨著價電子數的增加，花色苷溶液紅移的程度也顯著提高[19]。進一步的研究發現，花色苷與金屬離子可通過離子-偶極靜電相互作用達到穩定[19,23]。通過選擇較高價態或是較多電荷的金屬離子，可增強花色苷與金屬離子的相互作用能力。例如，相比于Fe2+，Fe3+由于最外層電子軌道只有1個電子占據，并呈高自旋狀態，這將更有利其與花色苷分子的結合[23]。此外，有學者發現，某些多糖、蛋白和多酚類物質亦能夠與金屬離子作用，從而促進和提升后者的輔色效果[24]。對照本試驗發現，通過添加酚酸后，Al3+和K+處理的模擬葡萄酒增色和紅移效果均有所增強，同樣對其CIELab顏色參數也產生積極影響。而對于輔色效果較好的Mg2+卻出現“反輔色作用”。ELHABIRI等[25]研究發現，兒茶素等酚類物質能與Fe3+形成穩定的化合物，從而影響Fe3+與溶液中其他物質的相互作用。因此，我們推測，酚酸和Mg2+之間可能會發生相互作用，從而減弱Mg2+的作用效果。但由于本試驗所涉及的金屬離子和酚酸種類相對較少，具體的反應機理還有待進一步的研究。

a-K+添加香草酸；b-Mg2+添加香草酸；c-Al3+添加香草酸；d-K+添加原幾茶酸；e-Mg2+添加原幾茶酸；f-Al3+添加原幾茶酸圖3 不同酚酸濃度含金屬離子模擬葡萄酒ΔE的影響Fig.3 The effect of different phenolic acid concentrations on ΔE of the pigment/metal ion simulated wine solution

4 結論

本試驗采用紫外-分光光度法和CIELab顏色空間法，研究了K+、Mg2+和Al3+在不同濃度及添加酚酸條件下對模擬葡萄酒溶液產生的輔色效果，結果表明：

(1)隨金屬離子摩爾濃度增加，Al3+處理可使模擬葡萄酒溶液呈現明顯的增色和紅移效應，Mg2+可使模擬酒產生增色效應但不產生紅移效應，K+處理未產生明顯的輔色效果。同時，Al3+和Mg2+處理均會明顯改善模擬酒的CIELab顏色參數，在相同摩爾濃度比下，3種離子的輔色效果表現為Al3+>Mg2+>K+的作用趨勢。進一步分析顏色參數對ΔE的貢獻發現，ΔE變化主要與量變因素有關。

(2)在含花色苷-金屬離子的模擬葡萄酒中分別添加固定濃度的原兒茶酸和香草酸，與僅添加花色苷-金屬離子的模擬酒相比，添加酚酸可使K+和Al3+處理的模擬酒輔色效果有所增強，且香草酸的效果優于原兒茶酸。而含Mg2+的模擬酒中的酚酸處理卻具有反輔色作用。

(3)在固定金屬離子摩爾濃度的模擬葡萄酒中添加不同濃度酚酸發現，較低濃度的酚酸會對3種離子的輔色效果及顏色參數產生一定的負面影響，但隨酚酸濃度升高，三者的輔色效果均有所提升，且Al3+的輔色效果優于Mg2+和K+。