玉米谷蛋白水解物對乙醇誘導損傷LO2細胞的保護作用

崔寧，劉曉蘭*，李冠龍，鄭喜群2,

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾，161006)3(黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶，163319)

氧化應激是指在體內外有害因素刺激下，體內自由基增加或機體抗氧化保護能力減弱，導致氧化系統和抗氧化系統失衡[1]。在此狀態下，過多積累的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會造成核酸、蛋白質和脂質等生物大分子的損傷，進而可能導致慢性退行性疾病的發生[2-5]。抗氧化劑可通過中和自由基、清除氧化劑或防止氧化劑轉變為毒性更強的化合物，減緩或抑制細胞損傷，達到抗氧化的目的[6]。抗氧化劑又可分為人工合成抗氧化劑和天然抗氧化劑。近幾年來，因人工合成抗氧化劑的安全性受到質疑，所以尋找來源安全的天然抗氧化劑具有必要性。

玉米蛋白粉是玉米濕法生產淀粉的主要副產物之一，其中玉米谷蛋白含量占其總蛋白含量的22%左右[7]，玉米谷蛋白中富含谷氨酰胺，谷氨酰胺是細胞增殖的主要能源，又是合成體內極其重要的抗氧化劑——還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的前體物質[8]。然而由于玉米谷蛋白水溶性差等的原因，限制了其功能性的發揮和在食品工業中的應用[7-9]。有研究[10-11]表明，通過蛋白酶水解的方式可以改善蛋白質的溶解度。而目前有關玉米谷蛋白水解物(corn gluten hydrolysate，CGH)的研究主要集中于水解物的制備及其物性研究等方面。LI等[10]采用單酶水解玉米谷蛋白，探討不同水解時間的谷蛋白酶解物抗氧化活性，得到具有較高抗氧化活性的CGH，本試驗采用雙酶協同水解玉米谷蛋白，不但減少了加酶量和水解時間，還提高了水解物的抗氧化活性。楊翠等[12]采用堿性蛋白酶水解玉米谷蛋白得到CGH，然后采用超濾、凝膠過濾層析和高效液相色譜法分離純化CGH，發現CGH具有良好的抗氧化活性。以上的研究均使用化學法來評估CGH的抗氧化活性，化學法雖然快速，但無法反映體內復雜的生理過程和作用機理，而細胞模型法能準確模擬生物環境。目前，尚未見用細胞模型法評估CGH抗氧化活性的相關報道。本文采用雙酶協同水解法獲得CGH，采用乙醇誘導LO2細胞氧化損傷模型對CGH的抗氧化應激作用進行研究，為CGH在食品領域的應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉，黑龍江龍鳳玉米開發有限公司；α-淀粉酶(2.0×105U/g)，食品級，北京雙旋微生物培養基制品廠；堿性蛋白酶(2.1×105U/g)、復合蛋白酶(2.3×104U/g)，食品級，丹麥諾維信公司；DPPH(純度≥95%)、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′, 7′-dichlorofluorescent yellow diacetate，DCFH-DA)，美國Sigma公司；細胞培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)(高糖)和胰蛋白酶，美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，德國PAN公司；噻唑蘭(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1810型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PB-10型pH計，賽多利斯科學儀器有限公司；PC/PLC-LD-53型冷凍干燥機，美國MILLROCK公司；NV4750E二氧化碳培養箱，NUAIRE(美國)公司；LX73熒光倒置顯微鏡，Olympus(日本東京)公司；EnSpire多功能酶標儀，珀金埃爾默(美國)公司產品；96孔板、6孔板、細胞培養瓶和移液管，Corning(美國)公司。

1.3 CGH的制備

精確稱取一定量的玉米谷蛋白，配制成pH 7.0，底物質量濃度為5 g/100L的蛋白懸液，先后加入復合蛋白酶和堿性蛋白酶進行水解，復合蛋白酶加量為0.6 g/100g底物，水解(溫度50 ℃，pH 7.0)60 min后立即用1 mol/L NaOH調節反應體系pH至8.5，升溫至60 ℃，加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶加量為2 g/100g底物，水解(溫度為60 ℃，pH 8.5)50 min，反應結束后于沸水中滅酶15 min，于4 000 r/min離心15 min，將上清液冷凍干燥后備用。

1.4 蛋白含量測定

采用微量凱式定氮法，按GB 5009.5—2010執行。

1.5 水解度(degree of hydrolysis，DH)測定

采用pH-stat法[7]測定水解度。當蛋白質被蛋白酶水解時，肽鍵斷裂，有羧基和氨基產生，會使反應體系的pH值下降。通過滴加NaOH溶液使水解液維持pH穩定，再通過加入的NaOH溶液體積來衡量肽鍵的斷裂情況，計算出玉米蛋白的DH。DH計算如公式(1)所示：

(1)

式中：VNaOH，反應中消耗的堿體積，mL；NNaOH，反應中維持pH穩定時堿當量濃度，mol/L；α，α-氨基酸解離度；Mp，反應體系中的蛋白總量，g；htot，1 g蛋白中肽鍵的克當量數，玉米蛋白取8.38。

1.6 抗氧化活性測定

將凍干后的CGH配成蛋白質量濃度為0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL的溶液，測定抗氧化活性。參考文獻[7]的方法測定CGH的DPPH自由基清除能力、羥自由基(·OH)清除能力和Fe2+螯合能力。

1.7 細胞培養

LO2細胞培養于37 ℃、CO2含量為5 L/100L的培養箱中，參照文獻[13]的方法進行傳代培養。實驗選用20～30代細胞。

1.8 MTT法測定CGH對LO2細胞存活率的影響

參照文獻[13]的方法，將對數期LO2細胞，以細胞密度為1×105cells/mL接種至96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液培養24 h，然后每孔加入100 μL終質量濃度為12.5、25、50、100、200、300、400、500、1 000、2 000 μg/mL的CGH培養液，培養細胞24 h后每孔加入終質量濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液培養4 h，棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，在37 ℃ 500 r/min微孔板振蕩儀振蕩10 min，在490 nm用酶標儀檢測OD值，測定細胞存活率。

1.9 氧化應激模型構建

將對數期LO2細胞，以細胞密度為1×105cells/mL接種至96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液培養24 h，實驗分為樣品組和對照組，樣品組每孔加入100 μL乙醇溶液(1640培養基配制)，使終體積分數為1%、2%、3%、4%、5%，對照組每孔加入100 μL不完全培養基，繼續培養細胞24 h后測細胞存活率，測定方法同1.8。

1.10 CGH對乙醇誘導損傷LO2細胞的保護作用

取對數期LO2細胞，以細胞密度為1×105cells/mL接種至96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液培養6 h，實驗分為樣品組、酒精組和對照組。待細胞貼壁后，樣品組中每孔加入100 μL樣品溶液，使樣品終質量濃度為25、50、75、100、200 μg/mL，對照組和酒精組各加入100 μL不完全培養基，繼續培養24 h，24 h 后對照組加入100 μL不完全培養基，樣品組和酒精組加入100 μL終體積分數為4%的乙醇溶液，將96孔板繼續培養24 h，24 h后測細胞存活率，測定方法同1.8。

1.11 CGH對LO2細胞內ROS的清除能力測定

參照文獻[11]的方法測定細胞內ROS的清除能力。

例 2：“It’s a Cheshire cat,”said the Duchess.“That’s why.Pig!”

1.12 數據處理

實驗中的數據均以平均值±標準偏差表示。用SPSS Statistics19.0進行統計學分析，數據間的顯著性差異采用單因素方差分析[最小顯著差別(least significant difference，LSD)檢驗]，P<0.05為差異性顯著水平。用Graph Pad Prism 5繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 CGH體外抗氧化活性分析

如表1所示，CGH能夠有效清除·OH、DPPH自由基和提高Fe2+螯合能力，且在一定范圍濃度內，抗氧化活性隨著CGH濃度的增加而遞增；當CGH的蛋白質量濃度在2 mg/mL時，其對·OH清除率、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力分別為(86.69±0.022)%、(60.56±0.369)%和(91.58±0.025)%，表明CGH具有良好的抗氧化活性。

表1 CGH的濃度對·OH清除能力、DPPH自由基清除能力和Fe2+螯合能力的影響 單位；%

從表1中可以看出，CGH具有很好的·OH清除能力、DPPH自由基清除能力和Fe2+螯合能力。酶法改性使得一些配位能力較強的基團例如羰基裸露出來，易于與Fe2+發生絡合反應，使其具有更好的金屬離子鰲合能力[14]。CGH良好的金屬螯合能力可以通過螯合Fe2+來阻止Fe2+與H2O2反應產生·OH。同時，CGH中一些疏水性基團的暴露，增強了其與DPPH自由基反應能力，從而提升了對DPPH自由基的清除能力。這與王曉杰等[14]的研究一致。以上結果表明CGH既是良好的供氫體，也是Fe2+螯合劑，能通過抑制Fenton反應而減少羥基的生成，提高自由基的清除能力，從而消除自由基對機體造成的氧化性損傷。

2.2 CGH對LO2細胞存活率的影響

如圖1所示，不同濃度的CGH對LO2細胞存活率存在顯著性差異(P<0.05)，與對照組相比，CGH質量濃度為12.5～2 000 μg/mL時，細胞存活率均大于對照組細胞存活率，即可在此濃度范圍內進行后續試驗研究。

從圖1中可以看出質量濃度為25～2 000 μg/mL時，細胞存活率顯著高于空白對照組(P<0.05)，這是由于水解物中的一些小分子肽作為營養物質被細胞吸收，從而促進了LO2細胞的增殖。

圖1 CGH對LO2細胞存活率的影響Fig.1 The effect of CGH on the survival rate of LO2 cells注：不同小寫字母表示樣本間差異有統計學意義(P<0.05)(下同)

2.3 乙醇誘導LO2細胞損傷的模型建立

乙醇在細胞代謝過程中會產生大量的ROS和超氧陰離子，過量的自由基可引起氧化應激，最終導致細胞凋亡[15-17]。

乙醇誘導損傷LO2細胞模型的建立，是利用一定濃度的乙醇溶液作用細胞，使細胞損傷程度在60%～70%，然后完成生物活性物質相應功能的評價。因此，有必要探索在不同濃度乙醇條件下，LO2細胞存活率的情況，確定乙醇誘導損傷LO2細胞的最佳作用濃度。通過MTT法測定不同體積分數0.5%、1%、2%、3%、4%、5%乙醇對LO2細胞存活率的影響，不同濃度乙醇作用LO2細胞24 h，然后測定細胞存活率，結果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對LO2細胞存活率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the survival rate of LO2 cells

從圖2中可以看出，不同濃度的乙醇對LO2細胞的生長均有一定抑制作用，且細胞存活率隨乙醇濃度的增加而減小，各乙醇濃度處理組與對照組相比均有極顯著差異(P<0.05)。在乙醇體積分數為4%時，LO2細胞的存活率為(73.22±3.88)%，此濃度下的乙醇溶液對細胞損傷效果顯著(P<0.05)。在光學顯微鏡下觀察不同濃度乙醇處理的細胞形態，發現正常培養的細胞呈梭形，形態完整，大小均一；乙醇體積分數為0.5%、1%、2%時，細胞的形態與正常組基本無差異，乙醇體積分數為3%、4%時，細胞密度顯著減少(P<0.05)，形態未有顯著變化；乙醇體積分數為5%時，細胞密度顯著減少(P<0.05)且大部分細胞已經失去原有細胞形態。因此建模時乙醇的最佳體積分數可選取4%。這與黃素瓊等[13]的研究結果一致。

2.4 CGH對乙醇誘導LO2細胞氧化損傷的保護作用

利用前期已建立成功的乙醇誘導損傷LO2細胞模型，研究CGH對乙醇誘導氧化損傷LO2細胞的影響。實驗中，乙醇體積分數為4%，樣品的質量濃度梯度為25、50、75、100、200 μg/mL。結果如圖3所示。

圖3 CGH對乙醇誘導LO2細胞氧化損傷的影響Fig.3 Effect of CGH on ethanol induced oxidative damage in LO2 cells

2.5 CGH對乙醇損傷后LO2細胞內ROS含量的調節作用

ROS是細胞內氧分子結合電子后的產物，包括超氧陰離子、H2O2和·OH等，在細胞中能與生物大分子結合，破壞其生理活性，進而對細胞造成損傷。圖4為不同濃度CGH作用LO2細胞后，細胞內ROS相對水平。

圖4 CGH對乙醇損傷后的LO2細胞內ROS含量的影響Fig.4 Effect of CGH on ROS content in LO2 cells after ethanol injury

從圖4中可以看出，與對照組相比，經4%乙醇誘導損傷后的LO2細胞中ROS含量顯著提高(P<0.05)，表明乙醇誘導氧化應激導致LO2細胞內ROS含量大量積累。與損傷組相比，經不同濃度CGH預處理后LO2細胞內ROS含量顯著下降(P<0.05)。CGH在25 μg/mL時對處理組細胞內ROS清除能力較損傷組提高約3倍。

圖5中的系列照片表示的是CGH在不同濃度下預處理LO2細胞后，用熒光倒置顯微鏡拍攝的細胞熒光照片。其中圖5-a為對照組，圖5-b為4%乙醇誘導損傷組，圖5-c～圖5-e依次為蛋白質量濃度為25、50、100 μg/mL CGH預處理組。

a-對照；b-損傷；c-25 μg/mL蛋白；d-50 μg/mL蛋白；e-100 μg/mL蛋白圖5 LO2熒光圖片Fig.5 LO2 cell fluoresence photograph

從圖5中可以看出，LO2細胞經乙醇誘導損傷后，細胞內ROS含量較高，熒光強度強。可能是乙醇進入LO2細胞內，使細胞內ROS含量增加進而導致細胞氧化損傷，當DCFH進入細胞后，被細胞內ROS氧化成DCF，使細胞內熒光強度增強，ROS值變大。經不同濃度的CGH處理細胞，細胞內的熒光強度均有所減弱。綜合圖4和圖5可以看出，當CGH質量濃度為25 μg/mL時，ROS含量最低，熒光強度最弱。可能是低濃度的CGH可以正向調節Nrf2通路，進而減少ROS的產生，而高濃度的CGH會激活Nrf2通路的逆反應，削弱CGH對ROS的清除能力。我們推測是CGH中含有一定量的谷氨酰胺，谷氨酰胺能夠通過調節Nrf2通路減輕因乙醇引起的細胞氧化損傷，減少ROS的產生，進而保護細胞免受氧化應激損傷[16]。WANG等[17]以玉米蛋白為原料，研究玉米蛋白對氧化損傷的肝癌細胞的ROS清除能力的影響，發現玉米蛋白具有很好的ROS清除能力。

2.6 CGH對LO2細胞內SOD的影響

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在人體氧化和抗氧化的平衡中起作用，可以通過清除過量的超氧陰離子自由基來保護細胞[18]。圖6為不同濃度CGH作用乙醇誘導損傷的LO2細胞后，細胞內SOD活力。

圖6 CGH對乙醇誘導損傷的LO2細胞內SOD活力的影響Fig.6 Effect of CGH on SOD activity in LO2 cells injured by ethanol

從圖6中可以看出，LO2細胞在經乙醇誘導損傷后，細胞內SOD活力顯著降低(P<0.05)。與氧化損傷組相比，CGH預處理后再進行氧化損傷，測得的細胞內SOD活力得到顯著提高(P<0.05)，CGH在50 μg/mL時，使損傷的細胞內SOD活力提高了24 U/mg prot。可以看出，一旦細胞內氧化還原狀態失衡，CGH可提高SOD活力，使細胞免受氧化損傷。

2.7 CGH對LO2細胞內GR和GSH水平的影響

谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)可以催化谷胱甘肽二硫化物(glutathione disulfide，GSSH)還原為GSH，GSH負責清除細胞內過量自由基[19]，在保護細胞免受氧化損傷中發揮著重要的作用。不同濃度CGH作用LO2細胞后，細胞內GR活力和GSH水平如圖7所示。

a-GR活力；b-GSH水平圖7 CGH對乙醇誘導損傷的LO2細胞內GR活力和GSH水平的影響Fig.7 Effect of CGH on GR activity and GSH level in ethanol induced LO2 cells

從圖7中可以看出，乙醇作用細胞后，細胞內的GR活力和GSH水平顯著降低(P<0.05)，經一定濃度的CGH預處理后的LO2細胞GR活力和GSH水平較損傷組顯著升高(P<0.05)。表明CGH能夠提高乙醇誘導損傷細胞內的GR活力和GSH水平，減輕乙醇對LO2細胞的氧化損傷，可能是CGH調控了谷胱甘肽系統，提升了GR的活性，清除細胞內過量自由基，進而起到保護細胞的作用。WANG等[19]研究了玉米蛋白抗氧化肽對HepG2細胞內抗氧化酶活力和總GSH水平的調控作用，結果表明玉米肽可以提高過氧化氫誘導損傷細胞的抗氧化酶活力。

3 結論

CGH具有良好的體外抗氧化活性，CGH的·OH清除率、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合率的IC50值分別為0.61、3.96、0.79 mg/mL。細胞試驗表明CGH對細胞無毒性作用，且能顯著改善乙醇誘導LO2細胞氧化應激損傷。CGH能夠降低細胞內的ROS水平，還能提高SOD和GR的活力及GSH水平，對乙醇誘導LO2細胞氧化損傷具有較為明顯的保護作用。本研究為玉米源抗氧化功能食品及食品基料奠定理論基礎。