上海市市售低溫酸奶中細菌多樣性的初步研究

鄭鈺倩，喻勇新,2*，趙海霞，唐笑，張華青，陳姝

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海，201306)

酸奶作為乳制品中重要的成員，以其獨特的風味、極高的營養價值倍受人們青睞。酸奶不但口感美味，而且具有促進消化吸收、維護腸道健康的功能。隨著酸奶生產規模的不斷擴大、加工生產產業鏈的不正規化、低質量奶源等原因，導致酸奶中存在一些有害細菌，使消費者食用后產生不良反應，如腹痛、腹瀉甚至中毒。GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》中對大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母和霉菌進行了限量規定。基于現有的研究，我們發現存在于酸奶中并可能帶來一定危害的細菌主要有黃色葡萄球菌、布魯氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特氏菌等[1]。部分細菌在國標中并沒有明確的規定，對酸奶食用安全性造成的影響不得而知，因此酸奶的安全問題值得引起乳制品相關行業的高度重視。

常見的酸奶分為自然發酵和商品化酸奶兩種。自然發酵的酸奶與市售的商品化酸奶在加工方面存在著一定的差異。研究發現南疆地區傳統發酵酸奶中厚壁菌門和變形菌門為優勢菌群，其中乳桿菌屬、鏈球菌屬、醋酸桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、芽孢桿菌屬的含量較多[2]。自然發酵的酸奶通常是牧民(如青藏高原地區)采用傳統而古老的發酵方法制作的，能夠產生大量優良的乳酸菌，具有降低膽固醇、抗氧化等保健功能，但自然發酵的酸奶中存在較多發酵菌種外的細菌。市售酸奶為商品化酸奶，通常采用工廠化加工進行大批量生產，上市前對酸奶進行質量檢測。一般而言，商業化酸奶的發酵時間相對較短，乳酸菌活菌數較多，后酸化作用較弱，但穩定性較高。

目前有很多檢測乳制品中細菌的方法，例如平板培養法、核酸探針法、PCR技術[3]等，這些技術具有簡單、易于操作等特點，但當不同菌落混雜在一起時，很難同時進行定性定量的檢測，且存在一些缺點如周期長、易受人為因素干擾等[4]。MiSeq系統是一種高端測序系統，可以同時進行合成與測序操作。隨著Illumina Miseq高通量測序技術的不斷完善、發展，現已成功應用在多個方面，如朱瀟等[5]利用該技術分析牦牛發酵乳制品中細菌菌群多樣性；盧圣鄂等[6]將該技術用于分析土壤真菌群落結構及多樣性。本研究采用宏基因組測序法，對酸奶樣品進行細菌采集測序，檢測出酸奶中可能存在的細菌，并進行分類分析，從原料乳、加工生產及包裝運輸3個方面分析可能來源。

1 材料與方法

1.1 材料

酸奶樣品于2021年3月2日購于上海泥城大潤發超市冷藏酸奶專區(0～4 ℃)。如表1所示，一共為16份樣品，包括國內8種知名品牌的酸奶A、B、C、D、E、F、G、H，以及A品牌不同系列的酸奶樣品8份(A1～A8)，其中A與A5為平行對照樣品。全程保證冷鏈保藏，運送至實驗室于0～4 ℃保存備用。

表1 酸奶樣品Table 1 Yogurt samples

1.2 儀器與設備

FastPre-24 MP型組織均質器，美國MP Biomedicals公司；#DP328型糞便基因組DNA試劑盒，天根生化有限科技公司；SLFPTAD多功能酶標儀，美國伯騰Biotek儀器有限公司；PowerPac HC電泳儀，上海伯樂生命醫學產品有限公司；5331PCR儀，美國Biometra公司；22331Eppendorf AG離心機，德國Hamburg公司；DW-40L508醫用低溫保存箱、HYC-290醫用冷藏箱，青島Haier特種電器有限公司；Illumina MiSeq PE300測序儀，上海美吉生物醫藥科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

用FastPre-24 MP組織均質器將樣品進行均質混勻，用移液槍吸取200 μL樣品于EP離心管中備用。

1.3.2 樣品基因組DNA提取

樣品基因組DNA提取采用糞便基因組DNA試劑盒，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.3.3 基因組DNA濃度及純度的檢測

通過酶標儀對樣品的DNA濃度以及純度進行測定分析。基因組DNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。

1.3.4 細菌的16S rRNA V3～V4區PCR擴增

以總DNA為模板利用細菌16S rRNA引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[7]實現V3～V4可變區的PCR擴增。擴增程序為：94 ℃預變性 3 min，35個循環(94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min)。擴增體系為50 μL，25 μL Premix Tap，2 μL dNTPs，4 μL引物(5 mol/L)，1 μL DNA模板，18 μL滅菌蒸餾水。

1.3.5 Illumina Miseq 測序

將PCR擴增子產物在MiSeqPE300平臺上進行雙端測序。美吉平臺MiSeq測序得到的是雙端序列數據，首先用QIIME(v1.9.1)軟件進行數據處理獲得合格的reads，根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接成1條序列，根據序列首尾兩端的barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為優化數據。

1.4 數據分析

樣品數據采用稀釋曲線分析、可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)分析以及β多樣性分析，運用Excel繪制OTU水平上樣本菌群分布群落Bar圖，運用生物信息學軟件 Geneious Prime(v2021.1.1)進行細菌序列的比對分析。

2 結果與分析

2.1 樣品16S rRNA V3～V4區擴增電泳結果

酸奶樣品總DNA經酶標儀檢測后，濃度均在10～15 ng/μL，且OD260/OD280均在1.8～2.0，表明DNA純度較高。圖1為樣品16S rRNA V3～V4區PCR擴增產物電泳分析結果，選用100 bp ladder為Marker。16個樣品在目標產物區域均出現明顯的條帶，而陰性對照無條帶，說明酸奶樣品中存在細菌。此外16個樣品的電泳條帶均勻單一，表明PCR擴增成功，可以進行后續的測序。

M-marker圖1 16S rRNA V3～V4區PCR產物瓊脂糖電泳Fig.1 The agarose gel electrophoresis of PCR products from V3～V4 region of 16S rRNA注：N1、N2分別為提取DNA時采用的陰性對照和PCR擴增時采用的陰性對照

2.2 稀釋曲線

圖2為樣品OTU稀釋曲線，反映群落豐富度的指數有Sobs、Chao、Ace、Jack、Bootstrap等，其中Sobs描述豐富度實際觀測值，更能直觀體現本研究樣品的豐富度，因此采用的多樣性指數為Sobs。由圖2可知，隨著測序深度增加，曲線趨于平坦，更多的測序量并不會產生更多的物種。表明測序深度合理，可以進行后續分析。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefraction curve

2.3 OTU分類

按照序列間相似度97%為閾值對非重復序列進行OTU聚類，去除嵌合體，測序結果顯示，酸奶樣品中的細菌一共包含16個OTU序列。根據分類學分析各分類水平(域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU)上的物種組成情況，如表2所示。OTU水平上樣本菌群分布群落條形圖如圖3所示。

2.3.1 發酵菌種

本研究采集的樣品共鑒定出9種發酵菌種，包括OTU1(Streptococcusthermophiles)、OTU2(Bifidobacteriumanimalissubsp.Lactis)、OTU3(unculturedStreptococcus)、OTU4(Lactococcuslactis)、OTU5(Lactobacillusacidophilus)、OTU6(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)、OTU9(Bifidobacteriumlongumsubsp.Infantis)、OTU13(Lactococcuspiscium)和OTU14(Lactiplantibacillusplantarum)。

根據調查顯示，市面上采用的發酵菌種大多為乳酸菌，乳酸菌包括嗜熱鏈球菌屬、雙歧桿菌屬，乳酸球桿菌屬、乳酸鏈球菌屬、保加利亞乳桿菌屬、嗜酸桿菌等，不同型號的酸奶根據需求對發酵菌種進行適當的調整。在所有樣品中均檢測到了嗜熱鏈球菌，且在各樣品中最為豐富。

2.3.2 污染菌

此外，鑒定出4種污染細菌，即OTU7(Anoxybacillusflavithermus)、OTU10(Acinetobacterbaumannii)、OTU11(Enterobactersp.)和OTU15(Arthrobactersp.)。

其中OTU10和OTU11可能為條件致病菌，由圖3-b可知，OTU10主要存在于D和F樣品中，而OTU11存在于F和A3樣品中。鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種革蘭氏陰性細菌，可引起免疫缺陷宿主的機會性感染，感染后具有很高的死亡率。大腸桿菌為腸桿菌屬中主要的細菌，大腸桿菌的分布廣泛，在各種動物和食物中較容易被檢出，大多不會引發疾病，但一些特殊血清的大腸桿菌具有一定的致病性。

OTU7和OTU15可能造成酸奶的腐敗變質。OTU15少量存在于A1與A3中，OTU7在樣品A、D和A3中豐度較高。節桿菌屬是最常見的分離細菌，常見于土壤和被工業化學品和放射性材料污染的環境中[8]。OTU7是常見的腐敗微生物之一，研究表明產芽孢嗜熱細菌屬的地桿菌和無氧桿菌是乳品工業中常見的污染物[9]。此外，OTU12的序列沒有檢索到可信度更高的物種信息，可能為不可培養的污染菌，在A8中豐度較高，在G、A2和A4中少量存在。

除了這些細菌之外，OTU8與OTU16不是細菌序列，而是屬于植物界中的李屬，從圖3-b可知，這兩種均出現在A2樣品中，該樣品為黃桃果粒風味發酵乳，推斷它們是由酸奶中的黃桃果醬等輔料帶入的。

2.4 主成分分析

圖4為主成分分析(principal component analysis，PCA)，通過比較不同樣本中細菌群落的組成來反映酸奶樣本間的差異，樣本物種組成越相似，其在PCA圖中的距離越近。A與A5為平行酸奶樣品，從圖4可知，兩者的測序結果基本一致；而不同品牌的酸奶樣品之間差異較大，尤其是B樣品。B樣品中含有大量的OTU2，故與其他樣品產生了較大的差異。

表2 OTU序列物種分類Table 2 The classification of species represented by OTU

圖3 基于屬水平15個OTU的菌種組成分析Fig.3 Bacterial composition analysis based on 15 OTU at the genus level注：由于OTU1相較于其他16種OTU來說數量過大，無法顯著呈現出其他物種的豐富度。因此圖3將OTU1去掉，為充分呈現出樣品之間的物種豐富度差異

圖4 不同酸奶樣品細菌菌群的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of bacterial community of different yogurt samples

2.4.1 不同品牌酸奶

樣品A、B、C、D、E、F、G和H分別來自8個不同品牌，這8種樣品均為以生牛乳為原料，不添加其他成分的原味風味發酵乳。結果表明，B、C、E、G和H品牌酸奶中沒有背景細菌(即酸奶中除了人為添加的發酵菌種以外的細菌統稱為背景細菌)，可初步判斷為安全性較高的酸奶。而在A、D和F樣品中，A存在較多的OTU7；D相較于A樣品，除了含有OTU7之外，還存在較多OTU10；F主要存在OTU10。

由結果可知，這8個品牌的酸奶品質并不相同，存在品牌之間的差異。所產生的差異可能是由于發酵劑、生產工藝等因素不同所致。

2.4.2 同種品牌不同型號酸奶

此外，對A品牌旗下的不同系列的酸奶樣品也進行了研究。其中A2樣品為復原乳酸奶，且A2與A3樣品中均添加了黃桃果醬，其余均為原味發酵乳。結果表明，A6與A7中背景細菌數量相對較少，A2、A4次之；A2中出現OTU8與OTU16兩種非細菌序列的污染物，可能是取樣時黃桃果醬偶然帶入所致；A3樣品中主要含有OTU11。A1、A5與A8均含有較多的OTU7。

結果表明同一品牌下的酸奶之間亦存在差異性。導致差異性的原因主要有3點：原料乳不同，分為生牛乳和復原乳兩種；發酵菌種不同；添加的輔料不同，添加果粒會對酸奶的菌群造成影響。

3 討論

3.1 商品化酸奶中發酵菌種的篩查

經比對分析，部分樣品中的發酵菌與表1中標簽所示完全一致，而部分樣品不完全一致。對此，分析有3點原因：其一，該商品化酸奶中實際添加的發酵菌種與標簽不符。根據GB 7718—2011《食品安全國家標準 預包裝食品標簽通則》，標簽內容需確保真實，因此標簽所示發酵菌種均按要求添加；其二，樣品中均按標簽添加了發酵菌種，但由于某些乳酸菌屬菌株之間的16S rRNA V3～V4區序列相似度較高，因此被歸類于同一OTU而沒有被區分開。經生物信息學軟件Geneious Prime進行序列比對后，發現乳桿菌屬的各個菌種之間16S rRNA V3～V4區相似度較高，且該區域片段長度有限(僅400～500 bp左右)，無法把某些菌種完全區分，因此某些乳酸菌種可能被歸類于乳桿菌屬；其三，某些發酵菌種添加量比較少，在后續加工和貯運環節中菌株失活甚至DNA降解，故未完全被檢測出。

3.2 酸奶中背景細菌的溯源及防控

本研究是檢測酸奶樣品中細菌的DNA，因此不能區分菌株是否為存活的狀態，只能說明背景細菌曾經在酸奶中存在過。背景細菌的存在，可能導致一些潛在的風險，因此從以下3個方面對其進行溯源分析。

(1)原料乳的質量：影響原料乳質量的因素包括奶牛乳房炎、奶牛飲食、養殖環境、擠奶過程及原奶的運輸過程。我國導致奶牛乳房炎最主要細菌是金黃色葡萄球菌和鏈球菌，發病率高達80%[23]。原料乳中曾檢測到不動桿菌屬，表明OTU10可能來自于患有乳房炎乳奶牛的原料乳中。此外，FERNANDO等[24]從奶牛糞便存儲池和地表水中分離回收到鮑氏不動桿菌，曹慧慧等[25]在奶牛養殖場采集原料乳的環節檢測到不動桿菌屬、節細菌屬、棒狀桿菌屬等。這些環節均可導致OTU10、OTU11與OTU15混入。

(2)酸奶生產加工過程：酸奶的加工過程包括配料、預熱、均質、殺菌、接種、發酵、攪拌、后熟以及包裝和運輸，其中復原乳酸奶還包括奶粉生產加工過程。污染細菌可能來源于生產器械、加工人員、果醬輔料等。COLERI CIHAN等[26]相關研究表明，OTU7有形成生物膜的潛力使其殘存于加工器械上。

(3)包裝運輸：包裝材料的質量、包裝環境也會對酸奶質量產生影響，對此可采用紫外滅菌等預處理保證其無菌狀態。酸奶大多采用冷鏈運輸，若在運輸過程中溫度控制不當，可能會造成酸奶腐敗變質。

3.3 與國家標準對比

在本研究中發現的7種背景細菌只有腸桿菌屬在國標中有明確的規定，雖然本實驗只對酸奶樣品中的細菌進行定性分析，但在F和A3樣品中檢出腸桿菌，說明商品化的酸奶樣品仍然存在潛在的安全風險。同時，酸奶國家標準中關于細菌部分是基于培養方法進行檢測的，大量不可培養的細菌無法有效檢出，因此測序結果中發現的部分難以培養細菌也可能存在潛在的隱患。隨著現代高通量測序技術的不斷發展，酸奶中微生物尤其是細菌的檢測和篩查有待進一步的提高和完善。

4 結論

綜上所述，本文通過宏基因組測序法分析8個品牌16種低溫酸奶樣品中的細菌多樣性，發現不同品牌和同一品牌的不同種類酸奶之間均存在顯著性差異。除了發酵劑中的乳酸菌之外，在商品化酸奶樣品中還發現了部分環境污染細菌，表明商品化酸奶在原料乳收集、加工生產和包裝運輸等環節仍然存在受環境細菌污染的潛在風險。本研究成果為商品化酸奶細菌群落研究和提高酸奶安全性提供一定的參考價值。