干酪乳桿菌對便秘小鼠腸道菌群的影響

曾獻春，朱雅琴，王明明，李佳雯，劉蔓萩，莊偉偉*

1(成都醫學院 檢驗醫學院，四川 成都，610500)2(西充縣農業農村局，四川 南充，637200) 3(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，中亞區域有害生物聯合控制國際研究中心，干旱區植物逆境生物學實驗室, 生命科學學院(新疆師范大學)，新疆 烏魯木齊，830054)

科技發展提高人類生活質量的同時，也形成了不良生活方式和不健康飲食習慣，大大增加了便秘、炎癥性腸病等腸道疾病[1-3]。其中便秘的患病率最高，大約30%的人在一生中會經歷便秘不適，老年人和婦女受之影響更甚[4]。長期便秘的患者，由于糞便在腸道內停留過久，導致腸道內有害物質增多，對腸黏膜完整和肝臟代謝造成損傷[5]。人類腸道中大約有1 014種微生物定植，統稱為腸道菌群，它們相互制約，相互依存[6]，在發揮宿主生理功能、抵抗感染和自身免疫性疾病的風險方面發揮著重要作用[7]。腸道菌群的多樣性受到病理狀況、遺傳、飲食習慣、藥物和環境等多因素的影響[8]。腸道菌群的變化與疾病的發生密切相關[9]。腸道菌群的破壞還會影響短鏈脂肪酸的產生，進而降低胰高血糖素肽的產生，抑制腸道的傳遞功能，進一步影響胃腸道動力學[10-11]。而腸道是重要的消化器官，對腸道的損傷可能導致營養吸收障礙和對身體的營養供應不足[12]，進而引發其他疾病。

目前，頑固性便秘主要依賴藥物治療，但存在腹瀉、腹痛、藥物依賴等副作用[13]。臨床實踐證實，益生菌在治療便秘過程中發揮較好的效果，安全無副作用。目前常用于治療便秘的益生菌有干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等[14-16]，緩解便秘效果較好。

在本研究中，我們通過16S rRNA基因的V3～V4可變區進行Miseq測序，分析復方地芬諾酯導致小鼠便秘后腸道菌群的變化，以及干酪乳桿菌干預便秘小鼠后腸道菌群變化。通過探究干酪乳桿菌對便秘小鼠腸道菌群結構及菌落豐富度的影響，推測干酪乳桿菌降解腸道毒素的益生途徑。研究結果可為干酪乳桿菌緩解便秘作用機制提供科學依據，也能夠拓寬干酪乳桿菌的益生功能和應用范圍。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級健康、昆明小鼠(生產許可證號：SYXK(川)2018-119)72只，4～5周齡，體重(20±2)g，成都達碩實驗動物有限公司，飼養環境溫度22 ℃，12 h 明暗交替，自由進食、飲水。

1.1.2 儀器與試劑

Arktik PCR儀、NanoDrop 2000超微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司；MISEQ測序儀、Illumina高通量測序儀，Illumina公司；QuantiFluorTM-ST 藍色熒光定量系統，Promega公司。

試驗菌株為課題組前期從8名3～8歲健康兒童糞便中篩選的具有高效降解3-甲基吲哚能力的干酪乳桿菌。MS培養基，北京路橋技術有限公司；復方地芬諾酯片，河南鼎昌藥業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 飼料制備

基礎飼料，成都達碩實驗動物有限公司提供；營養成分具體為(質量分數)：水分7.3%，粗蛋白質21.1%，粗纖維3.2%，粗脂肪5.4%，粗灰分6.0%，總磷0.94%，鈣1.22%。

1.2.2 溶液的制備

復方地芬諾酯溶液：復方地芬諾酯片每片含復方地芬諾酯2.5 mg，小鼠便秘模型灌胃復方地芬諾酯溶液的計量為20 mg/(kg BW·d)。

1.2.3 小鼠便秘模型建立

昆明雄性小鼠72只，4周齡，體重(20±2)g，體形豐滿，營養良好，行動靈敏，飲食、飲水及糞便正常。在實驗環境下給予基礎飼料，自由進食和飲水，適應性喂養1周后，隨機選取12只小鼠作為正常對照組[平均體重為(26.12±0.63)g]，灌胃0.5 mL生理鹽水；其余60只小鼠作為便秘組[平均體重為(26.54±1.19)g]，灌胃劑量為20 mg/(kg BW·d)復方地芬諾酯溶液，共計7 d。每天稱量小鼠體重，并根據體重調整灌胃量。每天記錄小鼠的飲食飲水量，收集每組小鼠在灌胃后6 h的糞便，計算小鼠糞便粒數、新鮮糞便質量及含水率，計算如公式(1)所示。以其均顯著低于正常對照組，確定便秘小鼠造模成功，挑取造模成功的小鼠進行后續試驗。

(1)

式中：A，新鮮糞便質量，g；B，烘干后糞便質量，g。

1.2.4 小鼠分組

正常對照組12只小鼠，便秘小鼠按體重隨機分成5組，每組12只。分組如表1所示。

表1 動物實驗分組情況Table 1 Experiments in rats grouping

飼喂時嚴格按實驗動物操作規程進行，飼養環境溫度22～27 ℃，相對濕度50%～70%，12 h明暗交替，每天上午9點稱量與添加飼料、計算飲水量并更換飲水瓶，清洗托盤，即時清除糞便等。每天10點開始灌胃，正常對照組與模型對照組小鼠灌胃生理鹽水，陽性對照組灌胃嗜熱鏈球菌，其余各組便秘小鼠灌胃相應濃度的干酪乳桿菌。飼養時間共計3 d。

1.2.5 樣本收集

實驗期間，每天灌胃后將小鼠放入高壓滅菌代謝籠，在灌胃6 h后收集各組小鼠糞便，稱量糞便質量、計數糞便粒數，新鮮糞便于60 ℃烘箱中烘干后計算糞便含水率。同時，無菌收集10粒新鮮糞便，分裝于2個滅菌EP管中，放入-80 ℃的冰箱保存。

1.2.6 小鼠糞便DNA提取

小鼠糞便中微生物群落總DNA抽提根據 E.Z.N.A.? soil DNA kit說明書進行。接著使用1%的瓊脂糖凝膠電泳(5 V/cm，20 min)檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop 2000微量分光光度計測定DNA濃度和純度(A260/230和A260/280)。

1.2.7 16S rRNA基因V3～V4可變區的PCR擴增

以1.2.6中提取的細菌基因組DNA為模板，引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對16S rRNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增。

1.2.8 PCR產物回收

PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化，并用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統對回收產物進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.2.9 小鼠腸道微生物群落結構的高通量測序分析

構建PE 300文庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序，由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序。

1.3 小鼠腸道菌群Alpha多樣性分析

使用UCHIME軟件將嵌合體序列去除，抽平后根據UPARSE軟件中相似度的默認值97%對序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)的聚類。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析，并在各個分類水平統計各樣本的群落組成。每組實驗數據以平均數±標準差(x±δ)表示，多組間比較采用單因素方差分析最小顯著差別(least significant difference，LSD)法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 干酪乳桿菌對便秘小鼠糞便粒數、質量、含水率的影響

由表2可以看出，與正常對照組相比，各便秘組小鼠糞便粒數顯著降低(P<0.05)，糞便粒數僅為正常對照組的29.17%～34.38%。干酪乳桿菌干預后，小鼠糞便粒數逐漸穩步上升。干預3 d后，干酪乳桿菌低、中、高劑量組小鼠糞便粒數分別為模型對照組的1.78、1.67、1.60倍(P<0.05)；其中效果最好的為低劑量組，優于陽性對照組(P>0.05)。

表2 干酪乳桿菌對便秘小鼠糞便粒數的影響Table 2 Effect of Lactobacillus casei on fecal number of constipated mice

由表3可知，與正常對照組相比，便秘組小鼠糞便重量明顯減少，僅為正常對照組的31.31%～39.39%(P<0.05)。干酪乳桿菌干預后，各組便秘小鼠糞便重量均有增加趨勢。干預3 d后，干酪乳桿菌低、中、高劑量組糞便質量分別為模型對照組的1.98、2.18、2.16 倍(P<0.05)；干酪乳桿菌中、高劑量效果較好，且與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)。

從表4可以得出，與正常對照組相比，便秘小鼠糞便中的含水率顯著降低，僅為正常對照組的61.41%～65.08%(P<0.05)。干酪乳桿菌干預3 d后，干酪乳桿菌低、中、高劑量組小鼠糞便含水率逐漸升高，分別為模型對照組的1.31、1.35、1.40倍(P<0.05)，其中高劑量組效果最好，且均與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)。

造模結束時，便秘組小鼠糞便粒數、質量以及含水率均顯著低于正常對照組。干酪乳桿菌干預3 d后，與模型對照組相比，干酪乳桿菌低、中、高劑量組小鼠的糞便粒數、質量以及含水率顯著升高(P<0.05)。表明復方地芬諾酯可以通過促進腸道水分吸收，造成因腸蠕動抑制而致的小鼠便秘。干酪乳桿菌可以通過抑制腸道水分重吸收，從而增加糞便中的含水率，達到緩解便秘的作用。

表4 干酪乳桿菌對便秘小鼠糞便含水率的影響 單位：%

2.2 小鼠腸道菌群Alpha多樣性分析

樣品中的細菌Shannon指數、Chao指數、Sobs指數、Simpson指數、Coverage指數等指標進行綜合分析，實現對樣品多樣性進行分析。反映群落豐富度的指數有Sobs、Chao，反映群落多樣性的指數有Shannon、Simpson，反映群落覆蓋度的指數有Coverage。詳細實驗結果見表5、表6。

表5 造模結束時小鼠腸道菌群Alpha多樣性分析Table 5 Analysis of Alpha diversity of intestinal microflora in mice at the end of modeling

表6 干酪乳桿菌干預后小鼠腸道菌群Alpha多樣性分析Table 6 Analysis of Alpha diversity of intestinal microflora in mice after intervention of Lactobacillus casei

在做干酪乳桿菌干預實驗前，隨機在各組小鼠中選擇幾只進行腸道菌群結構分析，無顯著差異。造模后，與正常對照組相比，其余各組的Chao指數較高。此外，Chao指數是Sobs數目的1.3倍左右，表明本研究的細菌多樣性測序深度達到了豐富度估計值的77%左右。便秘組小鼠Shannon指數、Simpson指數均高于正常對照組，表明小鼠便秘后腸道菌群多樣性有所降低，且各組間差異不大。所有樣品的覆蓋率介于99.22%～99.25%，表明糞便中幾乎所有的細菌物種信息都能被檢測到。

與模型對照組相比，干酪乳桿菌干預的3組便秘小鼠的Chao指數是Sobs數目的1.3倍左右，表明本研究的細菌多樣性測序深度達到了豐富度估計值的77%左右。與模型對照組相比，干酪乳桿菌低劑量組和陽性對照組的Shannon指數升高，而干酪乳桿菌中劑量組、高劑量組降低，表明干酪乳桿菌低劑量組、陽性對照組菌群多樣性較高，而干酪乳桿菌中劑量組、高劑量組較低。Simpson指數介于0.05～0.11，菌群多樣性差異不大。所有樣品的覆蓋率介于99.36%～99.42%，表明干預后小鼠糞便中幾乎所有的細菌物種信息都能被檢測到。

2.3 基于門水平上小鼠腸道菌群細菌分類學分析

便秘模型造模試驗結束時，6組小鼠腸道菌群隸屬于1域，1界，15門，21綱，41目，74科，180屬，317種。與干酪乳桿菌干預后相比，在門水平上增加了梭桿菌門(Fusobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)。在門水平上對優勢菌群進行分析，結果如圖1所示。優勢菌群為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)。

圖1 門水平上便秘小鼠腸道細菌優勢菌群分析Fig.1 Analysis of predominant bacterial microflora in intestinal tract of constipated mice at phylum level

干酪乳桿菌干預試驗完成后，6組小鼠的腸道菌群包含1域，1界，13門，19綱，39目，81科，198屬，335種。其中13門分別為擬桿菌門、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)、柔膜菌門(Tenericutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、Patescibacteria菌門、Epsilonbacteraeota門、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、藍細菌門(Cyanobacteria)和未分類到門的細菌(unclassified-k-norank-d-Bacteria)。在門水平上對優勢菌群進行分析，結果如圖2所示。優勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、Epsilonbacteraeota門。

以上結果提示干酪乳桿菌干預試驗完成后，6組小鼠腸道菌群中優勢菌群發生改變，灌胃干酪乳桿菌可以調節小鼠腸道菌群。

圖2 門水平上干酪乳桿菌干預便秘小鼠后腸道細菌優勢菌群分析Fig.2 Analysis of predominant bacterial microflora in intestinal after intervention of Lactobacillus casei at phylum level in constipated mice

2.4 基于屬水平上小鼠腸道菌群中優勢菌群分析

如圖3所示，便秘試驗結束時，6組小鼠腸道菌群中的優勢菌群為乳桿菌屬(Lactobacillus)、norank_f_Muribaculaceae、另枝菌屬(Alistipes)、Odoribacter。其中差異顯著的物種有乳桿菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group(P<0.05)，差異極顯著的物種有另枝菌屬、螺桿菌屬(Helicobacter)、普雷沃氏菌屬(Prevotellaceae-UCG-001)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)(P<0.01)、Prevotellaceae_NK3B31_group spp.(P<0.001)。造模后，與正常對照組相比，便秘小鼠腸道菌群中乳桿菌屬、另枝菌屬豐度有不同程度的降低，而普雷沃氏菌屬、norank_f_Muribaculaceaespp.豐度升高。提示便秘可導致腸道菌群發生改變。

圖3 屬水平上便秘小鼠腸道細菌組間差異顯著性檢驗Fig.3 Significant difference test of intestinal bacteria between groups of constipated mice at genus level注：*0.01

如圖4所示，干酪乳桿菌干預試驗完成后，6組小鼠的腸道菌群中的優勢菌群為norank_f_Muribaculaceaespp.、乳桿菌屬、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、嗜冷桿菌屬。其中差異顯著的物種有嗜冷桿菌屬、擬桿菌屬(Bacteroides)、Odoribacter(P<0.05)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)(P<0.01)、螺桿菌屬、普雷沃氏菌屬、普雷沃氏菌科NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)(P<0.001)。并且干酪乳桿菌干預后，與模型對照組相比，灌胃干酪乳桿菌的便秘小鼠腸道菌群中普雷沃氏菌屬、norank_f_Muribaculaceae豐度降低，另枝菌屬豐度升高；干酪乳桿菌中劑量組、干酪乳桿菌高劑量組、陽性對照組中乳桿菌屬豐度升高。此結果表明干酪乳桿菌可以提高腸道中乳桿菌屬、另枝菌屬的豐度，并降低條件致病菌普雷沃氏菌屬的豐度，從而改善腸道菌群。

圖4 屬水平上干酪乳桿菌干預便秘小鼠后腸道細菌組間差異顯著性檢驗Fig.4 Significant difference test of intestinal bacteria between groups of constipated mice after intervention of Lactobacillus casei at genus level

3 結論與討論

在動物的腸道中，各種菌群調節著腸道代謝和健康。很多研究表明新鮮糞便中菌群的變化能反映腸道內菌群的情況。通過菌群多樣性分析，發現覆蓋率指數越高，能夠檢測出樣本中序列的概率也就越高；ACE指數、Chao l指數和Shannon指數越大，則表明菌群的多樣性和豐富度越高；Simpson指數越大，說明群落多樣性越低[17]。本研究通過高通量測序技術對便秘后小鼠和干酪乳桿菌干預后小鼠的120個糞便樣品進行了測序，共獲得6 132 570×2條序列。經過隨機抽樣將測序深度均一化、數據標準化后，有效序列數為6 132 570，每個樣品的序列數為23 077，在97%的相似性水平上共劃分出1 531個OTU。對菌群進行多樣性分析發現，便秘組小鼠Shannon指數、Simpson指數均高于正常對照組，表明小鼠便秘后腸道菌群多樣性有所降低。與模型對照組相比，干酪乳桿菌低劑量組和陽性對照組的Shannon指數升高，而干酪乳桿菌中劑量組、高劑量組降低，表明干酪乳桿菌低劑量組、陽性對照組菌群多樣性較高，而干酪乳桿菌中劑量組、高劑量組的菌群多樣性較低。這與靳志敏等[18]用不同劑量植物乳桿菌對小鼠腸道菌群影響的研究結果相似，說明乳桿菌對腸道微生物區系具有一定的調節作用。

研究發現，乳酸菌通過競爭腸道黏附位點及分泌抗菌物質等方式抑制病原菌的定植和生長繁殖，維持腸道健康[15]。本研究對便秘小鼠進行干酪乳桿菌干預后，乳桿菌屬、另枝菌屬的豐度增加，普雷沃氏菌屬豐度降低。張董燕等[19]給實驗動物喂卷曲乳桿菌，發現糞便菌群物種豐富度提高了，而且糞便中厚壁菌門、乳桿菌屬和光崗菌屬的比例也明顯增加。乳桿菌屬是公認的益生菌，可通過產生乳酸、乙酸、過氧化氫、細菌素等抗菌物質，在宿主腸道環境中發揮有益作用，并抑制腸道有害細菌的增長來改善宿主腸道菌群的平衡，增強宿主對病原體的防御屏障功能[20]。1項研究表明，與對照組相比，功能性便秘的成人糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌數量明顯減少[21]。在服用益生菌后，短雙歧桿菌、長雙歧桿菌和青春雙歧桿菌的數量顯著增加。對補充益生菌前后糞便的分析有助于檢測益生菌引起的腸道菌群的確切變化[22]。乳桿菌屬、另枝菌屬屬于腸道有益菌，可以保護腸道免疫系統不受外界環境刺激，增強腸道的黏膜功能，從而對炎癥進行抵抗[23-24]。本實驗發現便秘導致小鼠體內產生了炎癥反應，在經過干酪乳桿菌干預后，干酪乳桿菌通過增加腸道中乳桿菌屬、另枝菌屬的豐度，以及降低條件致病菌普雷沃氏菌屬的豐度，影響了腸道菌群與腸道病原體之間的競爭，從而改善腸道菌群，達到緩解便秘的作用。

對小鼠腸道菌群在屬水平上進行優勢菌群分析，并且進行組間差異分析發現，造模結束時6組小鼠腸道菌群中的優勢菌群為乳桿菌屬、norank_f_Muribaculaceae、另枝菌屬、Odoribacter。其中差異顯著的物種有乳桿菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group(P<0.05)、另枝菌屬、螺桿菌屬、普雷沃氏菌屬、嗜冷桿菌屬(P<0.01)、Prevotellaceae_NK3B31_group(P<0.001)。與正常對照組相比，便秘小鼠腸道菌群中乳桿菌屬、另枝菌屬豐度有不同程度的降低，而普雷沃氏菌屬、norank_f_Muribaculaceae豐度升高。干酪乳桿菌干預后，小鼠腸道優勢菌群為norank_f_Muribaculaceae、擬普雷沃菌屬、嗜冷桿菌屬、另枝菌屬。其中差異顯著的物種有嗜冷桿菌屬、擬桿菌屬、Odoribacter(P<0.05)、葡萄球菌屬(P<0.01)、螺桿菌屬、普雷沃氏菌屬、普雷沃氏菌科NK3B31群(P<0.001)。與模型對照組相比，灌胃干酪乳桿菌的便秘小鼠腸道菌群中普雷沃氏菌屬、norank_f_Muribaculaceae豐度降低，另枝菌屬豐度升高；干酪乳桿菌中劑量組、干酪乳桿菌高劑量組、陽性對照組中乳桿菌屬豐度升高。提示便秘可導致腸道菌群發生改變。此結果表明干酪乳桿菌可以提高腸道中乳桿菌屬、另枝菌屬的豐度，并降低條件致病菌普雷沃氏菌屬的豐度，從而改善腸道菌群，達到緩解便秘作用。