混菌發(fā)酵制備茶籽多肽及其抗氧化作用

趙世光，謝東寶，儲(chǔ)欣穎，張宇，胡子敏，葛禮濤，錢(qián)森和，魏明*

1(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)2(安徽工程大學(xué)宣城產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，安徽 宣城，242000)

小分子多肽是蛋白質(zhì)不完全水解后產(chǎn)生的由不同氨基酸組成的多肽鏈的通稱(chēng)，相對(duì)分子質(zhì)量在5 000以下，具有比原料蛋白及氨基酸混合物更優(yōu)越的食品加工性能及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也被稱(chēng)為“生物活性肽”。多肽相比蛋白質(zhì)更易吸收，同時(shí)具有降膽固醇、降血壓、抗菌、抗氧化等生物活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、食品、化妝品等行業(yè)[1-2]。多肽的制備可采用酸堿水解、微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化及蛋白酶水解等方法，發(fā)酵法制備生物活性肽正成為肽制備工藝的研究熱點(diǎn)[3]。該方法利用單菌或混菌微生物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶水解蛋白原料，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的控制，定向產(chǎn)生具有特定生物功能的小分子多肽產(chǎn)物，具有成本低、無(wú)污染等特點(diǎn)。眾多學(xué)者在發(fā)酵菌種選育、發(fā)酵過(guò)程控制等方面開(kāi)展了研究，已成功開(kāi)發(fā)出大豆肽[4]、花生肽[5]、紫蘇肽[6]、榛仁肽[7]等多種生物活性肽。衰老、炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)理與體內(nèi)自由基過(guò)多或清除自由基能力下降有密切關(guān)系。植物蛋白來(lái)源的天然抗氧化肽多樣性廣、生物安全性高，在功能性食品、生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。抗氧化活性評(píng)價(jià)方法較多，其中ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、羥自由基(·OH)被廣泛用于抗氧化多肽的自由基清除能力評(píng)價(jià)[8-10]。根據(jù)自由基類(lèi)型、自由基清除機(jī)制的不同，以上三者可分別評(píng)估脂溶性、水溶性抗氧化劑的氮、氧自由基的清除能力，綜合采用以上3種測(cè)定方法可彌補(bǔ)單一方法的不足，更科學(xué)、全面地評(píng)價(jià)多肽抗氧化能力[11]。

茶籽是山茶科植物茶的果實(shí)，是茶葉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，除部分可留作茶樹(shù)有性繁殖種子及壓榨茶油外，目前尚無(wú)成熟的利用途徑，被散落在茶園中，任其自然腐化。茶籽中富含10%～15%的茶皂素、10%～20%的蛋白質(zhì)、30%～50%的糖類(lèi)物質(zhì)和一定量的多酚類(lèi)物質(zhì)。茶葉源蛋白、茶籽源多肽的研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)是繼茶皂素、茶多酚、茶多糖等活性成分之后又一新熱點(diǎn)[12-13]。現(xiàn)已相繼證實(shí)了茶葉、茶渣、茶籽中的蛋白質(zhì)組分及其多肽水解產(chǎn)物不同程度上具備抗氧化活性[14-15]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin I-converting enzyme，ACE)抑制活性[16]、降糖活性[17]。相對(duì)大豆、花生、玉米等來(lái)源的多肽而言，茶籽源多肽的制備及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)目前尚處在分離提取及活性評(píng)價(jià)的初級(jí)研究階段。

本研究以茶籽為原料，采用兩段順序發(fā)酵工藝，首先以白腐真菌靈芝菌的菌絲體增殖對(duì)茶籽原料中的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行有效釋放，進(jìn)而以解淀粉芽孢桿菌完成茶籽蛋白的生物轉(zhuǎn)化，制備茶籽多肽。基于Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得影響多肽產(chǎn)量的顯著因子后，設(shè)計(jì)多因素響應(yīng)面試驗(yàn)，得到茶籽多肽的最佳發(fā)酵工藝。并對(duì)發(fā)酵后產(chǎn)物進(jìn)行超濾分離及抗氧化活性分析，為茶葉籽、油茶籽、油茶餅粕資源的高值化利用及茶籽多肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茶籽原料采自安徽宣城地區(qū)的秋季茶園，經(jīng)干燥、脫殼、粉碎預(yù)處理后，備用；靈芝菌(GanodermalucidumUIM-281)，解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensPI142)為本實(shí)驗(yàn)室前期誘變選育的保存菌種，分別具備木質(zhì)素分解能力及蛋白酶分泌能力。

靈芝菌增殖培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基；解淀粉芽孢桿菌增殖培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基;混菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：茶籽粉70 g，葡萄糖4 g，蒸餾水1 L，pH 8.0。

1.2 試劑與設(shè)備

DPPH、ABTS、牛血清白蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無(wú)水乙醇等均為分析純，國(guó)藥試劑。Multiskan FC酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司；TGL-16A高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀；WKF-180高速粉碎機(jī)，淄博史克制藥設(shè)備有限公司；ZQZY-78BV恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵劑制備

靈芝菌種子培養(yǎng)：從保存的平板上，切取直徑1 cm的UIM-281菌絲1塊，打散后接入PDA培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)72 h，作為種子液。解淀粉芽孢桿菌種子培養(yǎng)：從保存的菌種斜面挑取1環(huán)PI142接至含30 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，作為PI142種子液。

1.3.2 混菌兩段發(fā)酵工藝流程

混菌兩段發(fā)酵工藝流程如下：

茶籽預(yù)處理(干燥、脫殼、粉碎至60目)→發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)配(主料茶籽、輔料葡萄糖)→接種UIM-281(裝液量100 mL/250mL)→Ⅰ段發(fā)酵→接種PI142→Ⅱ段發(fā)酵→離心(10 000 r/min，10 min)→取上清液、粗分離→茶籽多肽

1.3.3 混菌發(fā)酵培養(yǎng)條件主效應(yīng)因子篩選

基于前期UIM-281、PI142單因素發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)影響茶籽多肽產(chǎn)量的眾多因素進(jìn)行顯著性篩選。入選的因素為：主料茶籽粉、輔料葡萄糖、UIM-281接種量、初始pH、Ⅰ段發(fā)酵溫度、Ⅰ段發(fā)酵時(shí)間、PI142接種量、Ⅱ段發(fā)酵溫度、Ⅱ段發(fā)酵時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速。每個(gè)因素取高(+1)、低(-1)兩水平。基于PB試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，對(duì)主效應(yīng)因子進(jìn)行水平尋優(yōu)。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，選取主效應(yīng)因子為自變量，以多肽產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.5 多肽含量測(cè)定

多肽含量以酸可溶性多肽計(jì)，采用三氯乙酸法測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)采用雙縮脲法，以牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.009 5x+0.108 7，R2=0.998 9。

樣品測(cè)定：發(fā)酵液經(jīng)離心分離后，取5 mL上清液，加入5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸，充分混勻后，靜置10 min，8 000 r/min離心10 min，去除大分子蛋白，取上清液，采用雙縮脲法測(cè)定多肽含量，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算多肽含量。

1.3.6 茶籽多肽粗分離

發(fā)酵液經(jīng)固-液離心分離后，上清液加入2倍體積的無(wú)水乙醇，靜置沉淀12 h后，8 000 r/min離心10 min，去除大分子蛋白、多糖等組分；對(duì)離心后的上清液，采用杯式超濾器，選擇截留分子質(zhì)量5、1 kDa的平板式超濾膜片在流速10 mL/h、壓力0.3 MPa條件下對(duì)小分子多肽組分進(jìn)行粗分離，獲得分子質(zhì)量1～5 kDa的肽段(Ts)，測(cè)定其抗氧化活性。以未經(jīng)接種發(fā)酵的茶籽培養(yǎng)基上清液(T0)為對(duì)照；L-抗壞血酸(維生素C)為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率測(cè)定

參考郝金斌等[8]的方法稍加修改，將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，室溫下暗處放置12～16 h，將其用無(wú)水乙醇稀釋成在734 nm處吸光值達(dá)到0.7±0.02，得ABTS陽(yáng)離子溶液。將200 μL不同濃度的樣品液與800 μL ABTS陽(yáng)離子溶液充分混勻，置于暗環(huán)境準(zhǔn)確計(jì)時(shí)6 min，在734 nm處測(cè)吸光值， ABTS陽(yáng)離子自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示。以與樣品同一質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照，以質(zhì)量濃度與ABTS陽(yáng)離子自由基清除率之間做回歸方程并且計(jì)算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

(1)

式中：A0，無(wú)水乙醇替代樣品的吸光值；A1，添加樣品的吸光值；A2，無(wú)水乙醇替代ABTS溶液的吸光值。

1.3.8 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考王婕娉等[9]的方法稍加修改，精確稱(chēng)取2 mg DPPH，以無(wú)水乙醇定容至25 mL，放置時(shí)間不要超過(guò)4 h，得DPPH溶液。將200 mL不同濃度的樣品液和400 μL DPPH溶液混合均勻，置于避光的環(huán)境中反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)定吸光值，DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(2)所示。以與樣品同一質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照，以質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率之間做回歸方程并且計(jì)算IC50。

(2)

式中：A0，無(wú)水乙醇替代樣品的吸光值；A1，添加樣品的吸光值；A2，無(wú)水乙醇替代DPPH溶液的吸光值。

1.3.9 ·OH清除率測(cè)定

采用水楊酸-硫酸亞鐵法，參照許繼業(yè)等[10]的方法稍加修改，反應(yīng)體系中依次加入9 mmol/L 水楊酸-乙醇、9 mmol/L FeSO4、不同濃度的樣品溶液及8.8 mmol/L H2O2各1 mL，各組分37 ℃恒溫水浴反應(yīng)15 min后，在510 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值，·OH 清除率計(jì)算如公式(3)所示。以與樣品同一質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸做陽(yáng)性對(duì)照，以質(zhì)量濃度與·OH 清除率之間做回歸方程并且計(jì)算IC50。

(3)

式中：A0，去離子水替代樣品的吸光值；A1，添加樣品的吸光值；A2，去離子水替代H2O2溶液的吸光值。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。利用Minitab 18.0、Design expert 10.0、GraphPad prime 9.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，P<0.05 表示達(dá)到顯著性差異水平。圖表采用OriginPro 2019b繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌兩段發(fā)酵主效應(yīng)因子篩選

以發(fā)酵液中茶籽多肽產(chǎn)量為指標(biāo)，對(duì)影響兩段發(fā)酵過(guò)程的諸多因素進(jìn)行篩選，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示，各因子對(duì)茶籽多肽產(chǎn)量的顯著性分析如表2所示。從表2可以看出，備選的10個(gè)因素均對(duì)茶籽多肽的產(chǎn)量呈現(xiàn)正效應(yīng)影響，其中主料茶籽粉、初始發(fā)酵pH及Ⅰ段發(fā)酵溫度達(dá)到顯著水平(P<0.05)，是影響茶籽多肽產(chǎn)量的主效應(yīng)因子。因此，選定此3個(gè)因素作為下一步響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化因素。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman experimental design and results

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

由表2可知，茶籽粉、初始發(fā)酵pH及Ⅰ段發(fā)酵溫度3個(gè)因素均呈顯著正效應(yīng)，需要進(jìn)行爬坡試驗(yàn)以確定各因素的最陡上升路徑和最高取值水平。爬坡試驗(yàn)以各因素的PB試驗(yàn)中心點(diǎn)開(kāi)始，沿3個(gè)因素取值增加的方向移動(dòng)。從表3可以看出，當(dāng)茶籽粉70 g/L、初始發(fā)酵pH 9.0、Ⅰ段發(fā)酵溫度40 ℃時(shí)，多肽產(chǎn)量有明顯躍升，達(dá)到7.72 mg/mL，此后開(kāi)始回落，因此選擇T2組對(duì)應(yīng)的各因素的水平值為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平及影響因子的顯著性分析Table 2 Factors levels and significance analysis of Plackett-Burman

表3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化茶籽多肽發(fā)酵條件

基于PB試驗(yàn)及最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果分析，選定茶籽粉(X1)、初始發(fā)酵pH(X2)、Ⅰ段發(fā)酵溫度(X3)，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)，進(jìn)行多因素試驗(yàn)優(yōu)化，因素及水平見(jiàn)表4。通過(guò)對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到茶籽粉、初始發(fā)酵pH、Ⅰ段發(fā)酵溫度與茶籽多肽產(chǎn)量(Y)關(guān)系的回歸模型：Y=8.73+0.93X1+0.81X2+0.11X3-0.025X1X2-X1X3-0.042X2X3-0.90X12-1.99X22-1.33X32。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)因子及水平Table 4 Factors and levels of Box-Behmken design

表6為回歸模型方差分析。從表6可知，該模型P=0.005 6，失擬項(xiàng)P=0.600 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.963 7，說(shuō)明該回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，擬合程度良好，誤差小，可以用此模型對(duì)茶籽多肽的發(fā)酵進(jìn)行預(yù)測(cè)。模型中X1、X2、X12、X22、X32對(duì)Y值的影響均達(dá)到或超過(guò)顯著水平，說(shuō)明三因素對(duì)多肽產(chǎn)量的影響不是單純的線(xiàn)性關(guān)系，其各自的二次項(xiàng)也存在顯著影響；其影響效果為茶籽粉>初始發(fā)酵pH>Ⅰ段發(fā)酵溫度，其中茶籽粉、初始發(fā)酵pH均達(dá)到極顯著水平。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Result and design of Box-Benhmken

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)方差分析Table 6 Analysis of variance(ANOVA) analysis of Box-Behnken

對(duì)以上三因素作響應(yīng)面圖，從圖1可以看出，在所選變量區(qū)域內(nèi)，茶籽多肽產(chǎn)量存在極大值。回歸方程求解后，得到三因素的最優(yōu)值為：茶籽粉75.23 g/L、初始發(fā)酵pH 9.20、Ⅰ段發(fā)酵溫度39.87 ℃(取值40 ℃)，結(jié)合前期單因素試驗(yàn)及PB試驗(yàn)各因素的取值水平，確定優(yōu)化的發(fā)酵條件為：茶籽粉75.23 g/L、葡萄糖4.0 g/L、UIM-281接種量1%、初始發(fā)酵pH 9.20、Ⅰ段發(fā)酵時(shí)間24 h、PI142接種量0.5%、Ⅱ段發(fā)酵時(shí)間24 h、兩段發(fā)酵溫度恒定40 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min。在該條件下，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到茶籽多肽的實(shí)際產(chǎn)量為8.97 mg/mL，接近理論最大理論預(yù)測(cè)值9.06 mg/mL，表明該模型可以較好地指導(dǎo)茶籽多肽的混菌發(fā)酵生產(chǎn)。

a-初始發(fā)酵pH和茶籽粉；b-I段發(fā)酵溫度與茶籽粉；c-I段發(fā)酵溫度與初始發(fā)酵pH圖1 茶籽粉、初始發(fā)酵pH、I段發(fā)酵溫度間交互影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface diagram of tea seed concentration, initial pH and the first stage temperature

2.4 茶籽多肽的抗氧化活性

2.4.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

未發(fā)酵茶籽T0、發(fā)酵后茶籽多肽Ts及維生素C的ABTS陽(yáng)離子自由基清除效果如圖2所示。T0、Ts對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性存在正相關(guān)量效關(guān)系。同一濃度下，Ts的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力顯著高于T0，其ABTS陽(yáng)離子自由基半抑制濃度為0.358 mg/mL，顯著低于T0的IC50值0.807 mg/mL(P<0.05)。以上表明，茶籽原料經(jīng)發(fā)酵水解后產(chǎn)生的小分子質(zhì)量多肽具有更強(qiáng)的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。茶籽蛋白中富含色氨酸[18]，色氨酸是環(huán)狀氨基酸，含有苯環(huán)，能夠?yàn)樽杂苫峁┵|(zhì)子，減緩自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，推測(cè)茶籽中的蛋白質(zhì)組分經(jīng)微生物分解后，暴露出更多的色氨酸殘基，進(jìn)而賦予其ABTS陽(yáng)離子自由基高清除活力[19]。

圖2 不同組分對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性Fig.2 ABTS radical scavenging activity of different components

2.4.2 DPPH自由基清除活性

T0、Ts及維生素C對(duì)DPPH的清除能力如圖3所示。DPPH清除率隨T0、Ts濃度的增加而逐漸提高，不同濃度下Ts的DPPH清除率均>50%，質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)的最高清除率達(dá)到85.5%，顯著高于T0。以質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除率做回歸方程，得到T0、Ts、維生素C的IC50值分別為0.796、0.164、0.01 mg/mL，表明低分子質(zhì)量茶籽多肽Ts較未發(fā)酵茶籽原料具有更強(qiáng)的DPPH清除能力。王南南等[14]以酶解法制備茶渣蛋白肽，獲得的低分子質(zhì)量肽段(<5 kDa)具有最強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 不同組分對(duì)DPPH自由基清除活性Fig.3 DPPH radical scavenging activity of different components

2.4.3 ·OH清除活性

由圖4可知，相對(duì)于ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基清除活性而言，T0、Ts的·OH清除能力較弱，且整體顯著低于維生素C。Ts的·OH清除率隨其濃度的增加而逐漸提高，IC50值為3.537 mg/mL，顯著高于同濃度下T0的·OH清除活性。推測(cè)是茶籽經(jīng)UIM-281、PI142混菌發(fā)酵后，原料蛋白被水解成小分子多肽，其氨基酸組成中富含的苯丙氨酸、酪氨酸等疏水性殘基，提高了其·OH清除活性[20]。

圖4 不同組分對(duì)·OH清除活性Fig.4 The scavenging activity of different components on hydroxyl radical

3 結(jié)論

以茶籽為原料，采用靈芝菌和解淀粉芽孢桿菌混菌順序兩段發(fā)酵工藝制備茶籽多肽，并對(duì)茶籽多肽產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行研究。通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析試驗(yàn)，獲得了茶籽多肽制備的回歸模型和優(yōu)化參數(shù)為：茶籽粉75.23 g/L、葡萄糖4.0 g/L、UIM-281接種量1%、初始發(fā)酵pH 9.20、Ⅰ段發(fā)酵時(shí)間24 h、PI 142接種量0.5%、Ⅱ段發(fā)酵時(shí)間24 h、兩段發(fā)酵溫度恒定40 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，茶籽多肽產(chǎn)量達(dá)到8.97 mg/mL。以超濾法獲得低分子質(zhì)量肽段Ts的體外抗氧化能力顯著優(yōu)于未發(fā)酵茶籽原料，其ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、·OH清除半抑制濃度分別為0.358、0.164、3.537 mg/mL，可為茶籽資源的高值化應(yīng)用及茶籽多肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。