不同茶菌發酵液對病原細菌抑制作用的比較分析

胡松，汪鵬輝，劉斌杰，蘇經遷，檀青青，楊民和，王國紅

(福建師范大學 生命科學學院，福建 福州，350107)

紅茶菌(kombucha)，又稱茶菌，是以糖茶水為原料，經由酵母、醋酸菌和乳酸菌組成的共生菌群發酵而成的傳統發酵茶飲料[1]。用來發酵紅茶菌的茶葉一般為紅茶，大量文獻報道也可以利用其他原料來替代紅茶，如不同類型茶葉、水果、草藥和香料等，開發出新型風味和功能的產品[2-3]。銀杏是一種廣泛分布在我國的藥食同源植物，其葉片中化學物質種類繁多、含量豐富，活性成分如黃酮類化合物(16.6 mg/g)多達20幾種，萜類和總多酚含量分別占比0.42%和6.89%，必需氨基酸含量約占總氨基酸含量的40%，維生素、微量元素和酚酸類含量占比也很高[4]。有研究發現銀杏葉的主要提取物，如多糖類、黃酮類化合物和銀杏酚酸對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用[5-6]。使用替代原料在發酵過程中不僅可以為茶菌的生長提供碳、氮源，其成分的生物轉化也賦予茶菌不同的理化性質和更強的生物活性[2-3]。

紅茶菌發酵液能有效抑制革蘭氏陰性和陽性細菌生長[7]，但對霉菌的抑制作用有限[8]。目前對茶菌發酵液的抑菌作用研究基本集中在對抗生素敏感性致病菌，如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和幽門螺桿菌等的敏感性菌株[9]，而對耐藥菌的抑菌效果研究很少。病原菌的耐藥性問題日趨嚴重，究其原因是抗菌藥物的濫用，其中大腸桿菌與鮑曼不動桿菌傳播廣泛，極易對抗生素產生耐藥性，在外界不斷刺激下，亦可產生多重耐藥性[10-11]，如何有效抑制及感染后治療是目前亟待解決的難題。

本研究以紅茶、綠茶和銀杏葉3種材料制備茶菌發酵液，觀察并檢測發酵液的理化性質；采用瓊脂擴散法和牛津杯法體外檢測3種茶菌發酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等病原細菌的敏感性菌株和大腸桿菌、鮑曼不動桿菌的多重耐藥菌株的抑制效果；并選取銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌T5菌株，探究不同發酵時間對銀杏茶菌發酵液抑菌效果的影響。通過有益微生物的發酵作用提高茶葉和銀杏的抑菌生理活性，發展對病原細菌(特別是耐藥菌)具有抑制作用的功能微生物發酵產品。以期在大力倡導減少抗生素濫用的背景下，為新型食品防腐劑和抑菌藥物的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養基

紅茶菌菌種、大腸桿菌(Escherichiacoli)01菌株、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes),由福建師范大學生命科學學院微生物實驗室提供;多重耐藥性菌株大腸桿菌T5(耐氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素和妥布霉素)、大腸桿菌P1-D6(耐氨芐青霉素、氯霉素和慶大霉素)和鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，耐慶大霉素、妥布霉素、瀏陽霉素、卡那霉素和氨芐青霉素)，由福建師范大學生命科學學院付新苗教授惠贈。所有菌株使用前暫存于-4 ℃冰箱。

LB液體培養基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化鈉5.0，121 ℃滅菌30 min。LB固體培養基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化鈉10.0，瓊脂20，121 ℃滅菌30 min。哥倫比亞血瓊脂平板培養基購自成都彼樣生物科技有限公司。紅茶糖水培養液：紅茶5 g，白砂糖40 g，蒸餾水800 mL。綠茶糖水培養液：綠茶5 g，白砂糖40 g，蒸餾水800 mL。銀杏茶糖水培養液(g/L)：銀杏5 g，白砂糖40 g，蒸餾水800 mL。

1.2 茶葉及試劑

紅茶、綠茶、銀杏葉，福建省福州市市場；氫氧化鈉、酵母浸膏、瓊脂等，國藥化學試劑公司；細菌學蛋白胨，廣東環凱微生物公司。

1.3 供試菌培養

挑取1環供試菌(芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌T5、01、P1-D6、痤瘡丙酸桿菌)在LB固體平板上劃線，劃線后平板置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h，然后挑選大小適中的單菌落通過劃線進行2次純化培養。從純化的平板上挑取菌體接種于50 mL LB液體培養基內，置于搖床37 ℃，220 r/min培養24 h后，獲得菌懸液。

肺炎鏈球菌活化，挑取1環肺炎鏈球菌在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線，劃線平板置于37 ℃，5%～10% CO2恒溫培養箱培養24 h，然后挑選單菌落通過劃線進行2次純化培養。用移液槍吸取1 mL無菌水于純化的平板上，并用接種環刮取菌體混于無菌水中，制備菌懸液。

1.4 茶菌發酵及樣品制備

參照汪鵬輝等[12]的方法培養茶菌和制備發酵液樣品。發酵液分別以紅茶、綠茶、銀杏為原料。首先用沸水將所用器具紗布等清潔殺菌，在800 mL沸水中分別加入5 g紅茶、綠茶和銀杏葉，待浸泡10 min后用4層滅菌紗布過濾，在濾液中加入40 g白砂糖，充分攪拌得到糖茶水。待糖茶水冷卻至室溫后，用ddH2O補充至800 mL。在無菌環境中加入200 mL發酵7～10 d的茶菌母液，混勻，并以4層滅菌紗布封口，在28 ℃ 恒溫培養箱中發酵7 d，得到茶菌發酵液。

茶菌發酵液經濾紙過濾去除發酵液中較大顆粒雜質后，8 000 r/min離心5 min，取上清液用孔徑0.22 μm的濾膜過濾。收集濾液至100 mL，經凍干處理48 h后得到發酵液干粉，用1 mL無菌水稀釋，存放于-20 ℃待用。

1.5 茶菌發酵過程觀察和理化指標測定

茶菌發酵后，每天觀察發酵液的變化，至發酵后7 d記錄發酵液中菌膜、發酵液渾濁度、風味的數據；測定發酵液OD值、pH值、酸度和還原糖含量[12]。

1.6 抑菌試驗

采用牛津杯-瓊脂擴散法檢測不同茶菌樣品的抑菌能力[13]。LB培養基于超凈工作臺中混勻倒平板并冷卻至室溫后，加入100 μL供試菌懸浮液，涂布均勻。將滅菌后的牛津杯用無菌鑷子固定在涂布有供試菌懸液的培養基平板上，每個平板中放置3個牛津杯。待牛津杯固定后，向杯中加入200 μL以上凍干后稀釋的發酵液，置于37 ℃下恒溫培養24 h。觀察有無抑菌作用，測量并記錄抑菌圈的大小。

將100 μL肺炎鏈球菌懸浮液涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上，用直徑為9 mm的無菌打孔器在哥倫比亞血瓊脂平板上打孔，每孔加入200 μL發酵液樣品，置于37 ℃，5%～10% CO2恒溫培養箱恒溫培養24 h后。觀察抑菌圈的大小并做記錄。

將平板倒置于光線充足處，用游標卡尺“十”字法測量抑菌圈大小，并計算相對抑菌圈大小。相對抑菌圈大小計算如公式(1)所示：

相對抑菌圈/mm=D-d

(1)

式中：D，抑菌圈直徑，mm；d，打孔器直徑，mm。

1.7 發酵時間對茶菌抑菌作用的影響

按以上銀杏培養液的配方和培養方法，分別在發酵后第5、9、13、17、21天取樣，發酵液經過濾滅菌和凍干處理，編號后放置冰箱凍藏。按以上抑菌試驗方法觀察和測定不同發酵時間樣品對銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌T5菌株的抑制效果。

1.8 數據處理及分析

2 結果與分析

2.1 發酵液理化性質比較

經多次預試驗，紅茶菌在銀杏葉粉配制的糖水培養液中生長良好，培養5～14 d，在培養液表面形成明顯的菌膜。因此，進一步比較茶菌在不同原料配制的培養液中的表現。發酵7 d后，觀察和測定紅茶、綠茶、銀杏發酵液的理化表現和數據如表1所示。在綠茶和紅茶配制的茶糖水培養液中，菌體生長明顯，發酵后第2天即可見培養液中不斷產生細小氣泡，發酵后第3天在培養液表面形成明顯的菌膜。在銀杏糖水培養液中，菌體生長較慢，氣泡產生遲，數量也相對較少；菌膜的形成相比綠茶和紅茶糖水培養液慢，菌膜薄。未溶解的銀杏固形物易被絮狀的膜吸附，使發酵液變澄清。銀杏糖水經發酵后更加清亮，具有酸甜風味和清香。銀杏糖水發酵液在色、香、味方面要優于紅茶與綠茶，但銀杏茶菌的生長較慢，培養周期略長。發酵7 d后，紅茶、綠茶和銀杏發酵液的pH值分別為3.08、2.83和2.75。

表1 發酵7 d后3種茶菌發酵液理化性質比較Table 1 Comparison of physicochemical properties of three different kombucha tea after 7 days of fermentation

2.2 茶菌發酵液對病原細菌的抑制作用

以紅茶為原料的茶菌發酵液對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和痤瘡丙酸桿菌的相對抑菌圈直徑分別為4.5、4.33、16.7 mm(表2，圖1)，對痤瘡丙酸桿菌的抑制效果最為明顯；對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌01菌株、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6等菌株沒有抑制效果。以綠茶為原料的茶菌發酵液對供試的銅綠假單胞桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等菌株均有抑制作用；其中，對銅綠假單胞桿菌的抑制效果最為明顯，抑菌圈直徑達到23.33 mm，與其他菌株相比差異顯著(P<0.05)。和紅茶為原料的發酵液相比，以綠茶為原料的發酵液對大腸桿菌多重耐藥菌株T5和P1-D6也有較強的抑制作用，相對抑菌圈直徑達到18 mm左右(表2)。

表2 茶菌發酵液對致病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of tea fungus broth on growth of pathogenic bacteria N=3)

A-紅茶菌發酵液對銅綠假單胞菌的抑制作用；B-紅茶菌發酵液對金黃色葡萄球菌的抑制作用；C-紅茶菌發酵液對大腸桿菌T5菌株的抑制作用；D-綠茶菌發酵液對銅綠假單胞菌的抑制作用；E-綠茶菌發酵液對金黃色葡萄球菌的抑制作用；F-綠茶菌發酵液對大腸桿菌T5菌株的抑制作用圖1 茶菌發酵液對病原菌的抑菌作用比較Fig.1 Inhibitory effects of tea fungus broth on growth of pathogenic bacteria

2.3 銀杏茶菌發酵液對病原細菌的抑制作用

2.3.1 對敏感菌的抑制效果

銀杏茶菌發酵液對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌01菌株等抗生素敏感菌株的相對抑菌圈大小分別為21.67、12.50、2.03、4.33 mm(圖2)。銀杏茶菌發酵液對3株肺炎鏈球菌也有一定的抑制效果。對Ⅰ型肺炎鏈球菌、Ⅱ型肺炎鏈球菌和Ⅲ型肺炎鏈球菌的相對抑菌圈大小分別為3.67、9.83、6.50 mm(圖2)。

A-銀杏茶菌發酵液對不同病原細菌抑菌圈大小比較；B-銀杏茶菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用；C-銀杏茶菌對Ⅱ型肺炎鏈球菌的抑制作用圖2 銀杏茶菌發酵液對病原細菌的抑菌作用Fig.2 Inhibitory effects of ginkgo kombucha broth on growth of pathogenic bacteria

2.3.2 對多重耐藥菌的抑制效果

銀杏茶菌發酵液對多重耐藥性菌株鮑曼不動桿菌、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6的相對抑菌圈大小分別為7.83、13.00、15.33 mm(圖2-A，圖3)。

A-大腸桿菌T5菌株；B-大腸桿菌P1-D6菌株；C-鮑曼不動桿菌圖3 銀杏茶菌發酵液對多重耐藥菌的抑菌作用Fig.3 Inhibitory effects of ginkgo kombucha on growth of multidrug resistant bacteria

2.4 發酵時間對銀杏茶菌抑菌作用的影響

在17 d的發酵時間內，銀杏茶菌發酵液的抑菌作用隨時間變化而增強；發酵后第17天對銅綠假單胞菌和大腸桿菌T5抑制作用最強，抑菌圈大小分別達到2.91、3.69 cm(表3，圖4)。但是，發酵后21 d進一步觀察發現，在抑菌圈的范圍內，逐漸可見有細菌的生長，抑菌效果逐漸較弱。

表3 發酵時間對銀杏茶菌抑菌效果的影響 單位：cm

A-發酵5 d銀杏茶菌對銅綠假單胞桿菌的抑制作用；B-發酵9 d銀杏茶菌對銅綠假單胞桿菌的抑制作用；C-發酵17 d銀杏茶菌對銅綠假單胞桿菌的抑制作用;D-發酵5 d銀杏茶菌對大腸桿菌T5菌株的抑制作用；E-發酵9 d銀杏茶菌對大腸桿菌T5菌株的抑制作用；F-發酵17 d銀杏茶菌對大腸桿菌T5菌株的抑制作用圖4 不同發酵時間對銀杏茶菌抑菌作用的影響Fig.4 Effects of fermentation time on inhibition activities of ginkgo kombucha

3 結論

本研究結果顯示，3種茶菌發酵液對不同細菌的抑菌活性存在顯著差異。綠茶菌發酵液對供試病原細菌的敏感菌株和耐藥菌株均有明顯的抑制作用，其中對銅綠假單胞菌的抑制活性最強，對大腸桿菌01菌株的抑制活性最弱；銀杏茶菌發酵液對敏感菌株和耐藥菌株均有抑制作用，對金黃葡萄球菌的抑制活性最強，對大腸桿菌01菌株的抑制活性最弱。而紅茶菌發酵液只對痤瘡丙酸桿菌、金黃葡萄球菌和銅綠假單胞菌有一定的抑制作用，對芽孢桿菌和鮑曼不動桿菌、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6等3個耐藥菌株均無抑菌活性。總體上，3種茶菌發酵液的抑菌活性強弱依次為：綠茶菌>銀杏茶菌>紅茶菌。

除了痤瘡丙酸桿菌，綠茶菌發酵液對其他供試菌的抑制作用明顯優于紅茶菌發酵液。已有的研究結果表明，不同茶葉或不同植物經紅茶菌發酵后，其發酵液的抑菌效果存在差異[14-16]。如BATTIKH等[14]評估了紅茶、綠茶發酵21 d后的抗細菌和抗真菌活性，發現對所測試的病原微生物(Candidakrusei除外)具有抗菌潛力，而綠茶菌的抑菌潛力最強。與紅茶發酵后的發酵液相比，綠茶發酵液具有更寬的抑菌譜和更強的抑菌活性。紅茶和綠茶發酵后的抑菌能力存在差異，可能和以下因素有關：一是不同茶葉和植物葉片所含有的成分存在差異，如綠茶在兒茶素、黃酮類、酚酸類等化合物的種類和含量上與紅茶不同，因而其發酵后的產物存在差異[16-17]；經茶菌發酵后，發酵原料的生物轉化產物可能呈現不同的抑菌作用[16]。二是不同植物原料發酵后，發酵液中有機酸的種類和含量不同。實驗結果表明綠茶菌發酵后的酸度顯著高于紅茶菌；pH值的降低及大量有機酸的產生，尤其乙酸的產生也是茶菌具有抑菌效果的重要機制之一[8-9,18]。綠茶菌相比紅茶菌抗菌作用更強，未來可以深入研究其抑菌作用原理，并期望應用于醫療或食品領域。

紅茶菌在銀杏糖水中生長良好，發酵過程中pH值、酸度和還原糖變化與紅茶菌和綠茶菌相似，而菌膜形成表明使用銀杏發酵是可行的。銀杏葉中含有豐富的化學物質，藥用有效成分多達170余種[19]。銀杏葉提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陰性和陽性菌均有很好的抑制作用[5-6,13,20]，其中含有的多糖類化合物、黃酮類化合物及銀杏酚酸是抑菌的主要成分[4,20-21]。銀杏茶菌發酵液對供試的普通病原菌均有不同的抑制效果，而對肺炎鏈球菌和多重耐藥菌株的抑制作用，則進一步拓展了銀杏發酵產物的抗菌譜。隨著發酵時間延長，銀杏茶菌發酵液對銅綠假單胞菌和多重耐藥性大腸桿菌T5菌株的抑菌效果均顯著提高，在第17天達到最高，之后略有降低。推測在一定的發酵時間內，隨著微生物發酵過程的不斷進行，發酵液中有機酸、抗菌物質的產生和pH值的下降，促進發酵液的抑菌效果顯著提升。VALIYAN等[22]使用紅茶、綠茶、檸檬葉和薄荷葉為原料進行茶菌發酵，在第21天時顯示出最強的抑菌活性。VOHRA等[23]比較紅茶菌和綠茶菌發酵7、14、28、60 d的抑菌效果，發現第7天兩者均無抑菌效果，而第60天的抑菌效果最好，抑菌效果隨發酵時間增加而增強。添加銀杏提取物，利用豆醬發酵劑可以增強發酵產品的抑菌功能[24]。利用銀杏葉作為紅茶菌的替代原料發酵進行抑菌作用研究尚屬首次，銀杏葉經紅茶菌發酵后如何改變其活性成分種類和含量，是否增強抑菌活性，需要做進一步的研究。

過度使用抗生素導致致病菌產生耐藥性，伴隨著環境的篩選作用，可同時耐受多種抗生素的多重耐藥菌也不斷出現，病原菌的耐藥性已成為日益緊迫的全球健康問題[9]。茶葉主要成分及其制品在抑制耐藥菌株方面已經呈現一定的潛力[25]。以茶葉和銀杏為原料的茶菌發酵液作為一種天然發酵飲品，其對病原細菌(尤其是多重耐藥菌株)抑制作用的研究，將有助于食品、飼料防腐劑、抗生素替代品和功能飲料的創新和發展。