酸豆奶發(fā)酵過程中大豆異黃酮及風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律

劉婷，趙良忠*，周小虎，何初漫，張艷艷，張雪嬌

1(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽，422300)2(豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽，422300) 3(邵陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 邵陽，422300)

酸豆奶是指以大豆為主要原料經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后所得的產(chǎn)品[1]，大豆是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白，不含乳糖和膽固醇，是多不飽和脂肪酸以及異黃酮的豐富來源。大量研究表明，豆?jié){經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，不僅保留了原有的優(yōu)良品質(zhì)，還能改善不良風(fēng)味，增加苷元型大豆異黃酮的含量，賦予了產(chǎn)品更高的生理效價，具有發(fā)酵酸牛奶不可比擬的優(yōu)點(diǎn)[2-7]。

隨著膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，植物基酸奶在市場上逐漸表現(xiàn)出強(qiáng)勁的勢頭，酸豆奶成為各大高校、科研院、企業(yè)的研究熱點(diǎn)。近年來市面上也出現(xiàn)了酸豆奶系列產(chǎn)品，但總體上其感官品質(zhì)與牛奶酸奶相比仍存在差距。原因有二，一是酸豆奶存在豆腥味、苦澀味等一系列不良風(fēng)味；二是酸豆奶的質(zhì)地呈“豆腐狀”，與牛奶酸奶的柔滑糊狀質(zhì)構(gòu)差距較大，且存在后酸化，持水能力差等問題。不良風(fēng)味與質(zhì)構(gòu)是影響酸豆奶產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素，如果能夠?qū)⒉涣硷L(fēng)味和質(zhì)構(gòu)極大改善，對酸豆奶的發(fā)展具有重要研究意義。

本文利用HPLC測定酸豆奶發(fā)酵過程中大豆異黃酮變化規(guī)律，結(jié)合氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)技術(shù)分析酸豆奶發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的成分種類及含量變化情況，為更好地研究酸豆奶發(fā)酵工藝解決豆腥味、苦澀味等難題提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大豆為市售東北大豆；鼠李糖乳桿菌KJY-HN001-01-01由豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、二水檸檬酸鈉均為國產(chǎn)分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；蔗糖、乳糖、葡萄糖，均為食品級，欣爍生物科技有限公司；大豆苷(daidzin)、大豆苷元(daidzein)、染料木苷(genistin)、染料木素(genistein)、黃豆黃苷(glycitin)、黃豆黃素(glycitein)標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈均為國產(chǎn)色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

IS-RDD3 型臺式恒溫振蕩器，蘇州捷美電子有限公司；SB-5200DTD 型超聲清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-5299 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華有限責(zé)任公司；VELOCITY18R 型高速冷凍離心機(jī)，澳大利亞Dynamica公司；ULtiMate3000 型高效液相色譜儀，安捷倫公司；TQ8040三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基(121 ℃滅菌15 min)中，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化至3代，采用平板計(jì)數(shù)法得到活菌數(shù)為1×108CFU/mL 的菌液，備用。

1.2.2 酸豆奶制備

大豆清洗浸泡后通過二次漿渣共熟工藝制成豆?jié){，經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，從中選取對酸豆奶影響最為顯著的3種碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖。按照表1添加滅菌后(105 ℃，8 min)的碳源，按30 mL/L菌液接種量接種于豆?jié){中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵成酸豆奶。

1.2.3 酸度測定

參照 GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測定》。

1.2.4 感官評價

評定小組由經(jīng)過培訓(xùn)的10名食品專業(yè)學(xué)生組成，分別從滋味、氣味、質(zhì)構(gòu)、色澤、綜合接受程度5個方面進(jìn)行感官評定,如表2所示。

表1 不同碳源及其比例 單位：g/mL

表2 感官評價表Table 2 Sensory evaluation table

1.2.5 HPLC測定大豆異黃酮

參照 GB/T 26625—2011《糧油檢驗(yàn) 大豆異黃酮 高效液含量測定 高效液相色譜法》，做一定調(diào)整[8]。取15.00 g酸豆奶于50 mL具塞比色管中，加入80%甲醇溶液定容。超聲處理1 h(超聲功率288 W，溫度40 ℃)，高速冷凍離心機(jī)10 000 r/min 離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至10 mL，用10%甲醇定容。均勻取2 mL樣品過0.45 μm有機(jī)系濾膜，利用HPLC測定。液相色譜條件：流動相 A 為 0.1%乙酸溶液、流動相 B 為 0.1%乙酸乙腈溶液、波長 260 nm、流速 1 mL/min、柱溫 40 ℃、進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.6 GC-MS/MS測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

取酸豆奶樣品5 mL，在高速冷凍離心機(jī)10 000 r/min內(nèi)離心10 min。均勻取2 mL上清液樣品過0.22 μm水系濾膜，進(jìn)入系統(tǒng)測定。色譜條件：HP-5MS型石英毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度設(shè)定為280 ℃；程序起始溫度設(shè)定為40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至190 ℃，保持10 min， 然后以8 ℃/min升至240 ℃，保持15 min。質(zhì)譜條件：電子電離源(electron ionization, EI)；電子能量為70 eV；離子源溫度為250 ℃；接口溫度為280 ℃；掃描范圍為45～500m/z。參照參考文獻(xiàn)[9]做一定調(diào)整。

1.2.7 定性定量方法

利用計(jì)算機(jī)比對測試樣品對照標(biāo)準(zhǔn)譜庫(National Institute of Standards and Technology, NIST)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行成分鑒定，僅報(bào)道相似指數(shù)(similar index)和反相似指數(shù)(reverse similar index)均大于800的物質(zhì)。化合物相對含量按總離子圖峰面積歸一化計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)每組重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Excel 2017、Origin 2018 和 IBM SPSS Statistics 22.0 進(jìn)行圖像繪制及處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源及其比例對酸豆奶酸度的影響

由圖1可知，在發(fā)酵過程中，對照組酸豆奶的酸度雖隨著發(fā)酵時間延長而增加，但增幅明顯較低(P<0.01)，發(fā)酵終點(diǎn)酸度僅有(30.98±0.46)oT。添加同一碳源蔗糖、乳糖酸豆奶的酸度，隨著碳源比例的增加，酸度呈上升趨勢(P<0.05)；添加葡萄糖酸豆奶的酸度，呈現(xiàn)倒U型趨勢，在0.02 g/mL添加量時，酸度最高。到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時，添加0.01、0.02、0.03 g/mL的蔗糖、乳糖、葡萄糖的酸度分別是(37.97±0.26)、(39.12±1.14)、(48.82±1.13)°T和(39.37±0.54)、(43.37±1.67)、(47.75±1.39)°T 和(44.50±0.40)、(48.35±0.87)、(46.04±1.24)°T。不同碳源在相同添加比例條件下酸度也有顯著區(qū)別。0.03 g/mL添加量的蔗糖、乳糖酸豆奶酸度顯著高于其他兩種比例(P<0.05)，0.02 g/mL添加量葡萄糖顯著高于其他兩種比例(P<0.05)。

豆?jié){中的碳水化合物主要是棉籽糖、水蘇糖、蔗糖等低聚糖，缺少乳酸菌能利用的能源物質(zhì)，導(dǎo)致乳酸菌活力低、產(chǎn)酸低。向豆奶中添加一定量的蔗糖、葡萄糖、乳糖等能源物質(zhì)可以促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵[4]。周艷平等[4]研究發(fā)現(xiàn)不同碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖制備的大豆酸奶，達(dá)到相同發(fā)酵終點(diǎn)時，酸度差異較大，變化范圍在43～47 °T，這與本文研究結(jié)果相似。王浩[10]研究發(fā)現(xiàn)向豆?jié){中添加0.5%的乳糖制備的大豆酸奶的口感風(fēng)味較好，并且乳糖能夠很好的促進(jìn)乳酸菌在豆?jié){中的產(chǎn)酸。張秋香等[11]在對乳酸菌利用不同低聚糖研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對不同低聚糖的利用特性不同，產(chǎn)酸速率也不同，造成這種現(xiàn)象的根本原因是乳酸菌對不同糖類物質(zhì)代謝途徑不同[12]。

圖1 不同碳源及其比例對酸度的影響Fig.1 Effects of kinds and proportions of carbon sources on acidity

2.2 不同碳源及其比例對酸豆奶感官評價的影響

由表3可知，增加不同碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖的比例會顯著提升酸豆奶滋味、氣味、綜合接受程度方面感官評分(P<0.05)，對質(zhì)構(gòu)和色澤方面評分無顯著影響(P<0.05)。隨著葡萄糖比例增加，酸豆奶豆香味愈發(fā)濃郁，豆餿味變?nèi)酰肟谧涛断闾穑杂休p微澀口感；蔗糖比例增加，酸豆奶豆香味最濃，豆腥味最輕，幾乎沒有豆餿味，入口滋味口感酸甜適口，澀味最弱；隨著乳糖比例增加，酸豆奶豆香味較濃，仍有微弱豆餿味、豆腥味存在，入口滋味口感適中，苦澀味明顯。結(jié)果表明，不同碳源對酸豆奶感官品質(zhì)有明顯影響，同一碳源不同添加比例對酸豆奶感官品質(zhì)也有顯著影響，其中添加0.03 g/mL蔗糖、乳糖、葡萄糖酸豆奶滋味、氣味、綜合接受程度方面感官評分最高。這可能是由于乳酸菌只能利用豆?jié){中一小部分低聚糖而導(dǎo)致菌種繁殖速率過低、產(chǎn)酸、產(chǎn)香不夠，隨著碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖比例的增加，乳酸菌代謝糖類的能力增加，產(chǎn)品感官品質(zhì)也隨著提升。王浩[10]發(fā)現(xiàn)添加乳糖的酸豆奶在酸度和感官評價各方面均表現(xiàn)更優(yōu)秀，周艷平等[4]研究發(fā)現(xiàn)不同碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖制備的大豆酸奶的豆腥味風(fēng)味物質(zhì)含量較少，而酸類、酮類等酸奶香氣的典型化合物含量較多，這一結(jié)果表明額外添加碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖的酸豆奶，其產(chǎn)品的滋味和氣味等更佳，這均與本文研究結(jié)果相似。而表中質(zhì)構(gòu)和色澤評分無顯著影響，原因可能是僅通過肉眼感官觀察無法判斷質(zhì)構(gòu)和色澤細(xì)微的差別，若采用質(zhì)構(gòu)儀和色差儀測量，可能會出現(xiàn)不同結(jié)果。

表3 不同碳源及其比例對感官評價的影響Table 3 Effect of different carbon sources and their proportions on the sensory evaluation

2.3 酸豆奶發(fā)酵過程中大豆異黃酮變化規(guī)律

發(fā)酵過程中在乳酸菌中β-葡萄糖苷酶的作用下大豆異黃酮的組分和含量發(fā)生了改變，β-葡萄糖苷酶可以將糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為生理活性更高的苷元型異黃酮。未發(fā)酵前大豆異黃酮主要是結(jié)合型糖苷，發(fā)酵后糖苷型含量減少，游離型苷元增加[13]，同時產(chǎn)生了一系列代謝產(chǎn)物[14]。經(jīng)過前期碳源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到3種碳源的最優(yōu)添加比例為0.03 g/mL，后期大豆異黃酮變化規(guī)律實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為添加0.03 g/mL的蔗糖、乳糖、葡萄糖。

圖2可知，0 h酸豆奶中大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量分別為(67.70±0.69)、(135.15±2.25)、(0.11±0.02)、(2.76±0.16) mg/kg。經(jīng)過微生物發(fā)酵之后，不額外添加碳源的酸豆奶，其大豆苷、染料木苷含量減少至(12.65±0.84) mg/kg和(42.33±1.24) mg/kg，添加0.03 g/mL的蔗糖、乳糖、葡萄糖碳源的酸豆奶，糖苷型異黃酮整體呈大幅下降趨勢，大豆苷、染料木苷含量分別減少至(6.26±0.14)、(32.80±1.25) mg/kg和(21.48±0.68)、(36.58±0.57) mg/kg和(4.99±0.05)、(16.04±0.1) mg/kg，其中添加0.03 g/mL葡萄糖的酸豆奶糖苷型異黃酮下降率最高，達(dá)92.62%和88.13%。結(jié)果表明，外加碳源的酸豆奶其糖苷型異黃酮下降率與對照組差異顯著(P<0.05)。這可能是因?yàn)樘荚磿绊懭樗峋纳L代謝，合適的碳源可以促進(jìn)乳酸菌的生長，増強(qiáng)β-葡萄糖苷酶活性，促進(jìn)糖苷型異黃酮的轉(zhuǎn)化。周帆[15]研究發(fā)現(xiàn)4%～8%的乳糖更適合植物乳桿菌58的生長，β-葡萄糖苷酶活性顯著增加，能夠高效率轉(zhuǎn)化苷元型異黃酮。TSANGLIS等[16]發(fā)現(xiàn)外加1%葡萄糖輔助4種雙歧桿菌發(fā)酵豆乳，苷元型大豆異黃酮含量均有不同程度的增加。

此外不同碳源之間的糖苷型異黃酮下降率差異顯著，外加葡萄糖的效果明顯優(yōu)于其他兩種碳源(P<0.05)。添加0.03 g/mL蔗糖的酸豆奶苷元型異黃酮含量增加至(14.02±0.84)mg/kg和(11.10±0.51)mg/kg，添加0.03 g/mL乳糖、葡萄糖的酸豆奶苷元型異黃酮含量未有顯著變化(P>0.05)。造成這種現(xiàn)象的原因可能一是發(fā)酵時間不夠，在取樣時間點(diǎn)時苷元型異黃酮尚未被完全轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致苷元型異黃酮含量較低；二是乳酸菌可能優(yōu)先利用蔗糖，提高了β-葡萄糖苷酶的活性，苷元型大豆異黃酮含量主要由發(fā)酵過程中乳酸菌的β-葡萄糖苷酶活性決定[17]，最終導(dǎo)致在9 h時0.03 g/mL葡萄糖添加量的酸豆奶大豆苷元和染料木素含量顯著增加(P<0.01)。朱亞軍[18]研究發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌菌種和同種乳酸菌不同菌株轉(zhuǎn)化大豆異黃酮的時間和含量均有顯著差異(P<0.05)。是否優(yōu)先利用蔗糖、葡萄糖等情況也不相同。

a-對照組；b-添加0.03 g/mL蔗糖；c-添加0.03 g/mL乳糖；d-添加0.03 g/mL葡萄糖圖2 碳源對酸豆奶大豆異黃酮的影響Fig.2 Effect of carbon sources on isoflavones in fermented soybean milk

2.4 酸豆奶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律

風(fēng)味物質(zhì)是指一類能夠賦予食品風(fēng)味的物質(zhì)組成，包含氣味和滋味，是由一系列揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)共同組成[1]。在發(fā)酵過程中，乳酸菌通過代謝碳水化合物、蛋白質(zhì)等一系列生物化學(xué)過程形成揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。在糖酵解途徑中，乳酸菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)而通過EMP(Embden-Meyerhof-Parnas pathway)途徑、HMP(hexose monophophate pathway)途徑及HK(phosphate hexoglycolketoenzyme pathway)途徑等多種代謝途徑產(chǎn)生醛類、酮類、酸類和醇類等化合物；在蛋白質(zhì)水解途徑中，通過蛋白酶分解蛋白質(zhì)形成肽類和氨基酸等多種代謝物，其中部分氨基酸等小分子物質(zhì)進(jìn)一步形成揮發(fā)性芳香化合物[19]。在不同發(fā)酵時間內(nèi)主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的變化情況如圖3所示，酸豆奶在發(fā)酵過程中所測得揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和數(shù)量如表4所示。

圖3 不同發(fā)酵時間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量變化Fig.3 Relative content changes of volatile flavor substances at different fermentation times

表4 酸豆奶揮發(fā)性化合物數(shù)量單位：種

由表5可知，在發(fā)酵過程中共鑒定出72種化合物，包括酯類17種、酸類16種、酮類15種、醇類11種、醛類4種、酚類3種、烷烴1種、烯烴1種、其他類4種。不同發(fā)酵時間檢測揮發(fā)性化合物種類有差別且揮發(fā)性物質(zhì)含量存在顯著差異(P<0.05)。豆奶中1,2-庚二醇、2,3-丁二醇、1-辛烯-3-醇占主要比例，在微生物的代謝作用下，這些不愉快的風(fēng)味物質(zhì)都被代謝到較低或檢測不到的水平，并且形成了新的酸類、酮類、酯類和醛類等風(fēng)味物質(zhì)。酸豆奶發(fā)酵前后在風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成成分、相對含量上差異較大，醛類、酮類、酯類、酚類化合物含量及種類明顯增加，酸類含量和種類先增加后減少，但醇類明顯減少。

醛類化合物主要來自脂肪酸的氧化分解，一般氣味閾值較低對整體的氣味貢獻(xiàn)特別大。醛類在發(fā)酵過程中可以被氧化或還原為各自的酸或醇，醇類物質(zhì)與酸類物質(zhì)能夠形成酯類物質(zhì)。而醛類化合物在發(fā)酵后期含量仍居高不下的原因主要是5-羥甲基糠醛含量在醛類占較高比例，造成此種現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵乳在高溫加熱過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)所致，且糖含量(葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖)可顯著影響5-羥甲基糠醛的累積[20]。酮類物質(zhì)通常給整體風(fēng)味帶來愉悅感，隨著發(fā)酵時間延長酮類物質(zhì)的種類和含量增加，如2,3-丁二酮、2,3-戊二酮等物質(zhì)含量的累積，酸豆奶整體的風(fēng)味也呈現(xiàn)令人愉悅的奶油、干酪香氣。醇類物質(zhì)的含量和種類在發(fā)酵過程中明顯減少，1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇、2,3-丁二醇等具有蘑菇味、青菜味、油漆味的特征不良風(fēng)味物質(zhì)含量顯著減少。酯類化合物也是構(gòu)成香氣的重要物質(zhì)之一，乙酸乙酯具有醚香、甜的果香[21]，這些酯類的存在帶來了馥郁的香味。揮發(fā)性酸類物質(zhì)是由乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生的，酸類物質(zhì)中占主要比例的是甲酸、乙酸、3-甲基-2-富馬酸、α-酮戊二酸，這些酸類物質(zhì)能給整體風(fēng)味增加層次感。

表5 酸豆奶風(fēng)味物質(zhì)相對含量 單位：%

續(xù)表5

3 結(jié)論與討論

本研究通過添加不同比例的蔗糖、乳糖、葡萄糖碳源，探究在不同碳源及其比例的條件下，酸豆奶發(fā)酵過程中底物利用情況以及大豆異黃酮代謝和風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律。結(jié)果表明，向豆奶中額外添加蔗糖、葡萄糖、乳糖等碳源能有效促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)酸，縮短酸豆奶凝乳時間，不同碳源促進(jìn)產(chǎn)酸效果不同，同一碳源不同比例促進(jìn)產(chǎn)酸效果也不同。添加一定量的蔗糖、葡萄糖、乳糖等能源物質(zhì)不僅可以促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，還可以提升酸豆奶產(chǎn)品感官品質(zhì)。碳源對酸豆奶感官品質(zhì)有明顯影響，碳源相同添加比例不同對酸豆奶感官品質(zhì)影響也顯著。另外碳源對發(fā)酵酸豆奶異黃酮組分和含量影響差異顯著，外加葡萄糖轉(zhuǎn)化糖苷型異黃酮的效果明顯優(yōu)于其他兩種碳源(P<0.05)，外加蔗糖對增加苷元型異黃酮的效果明顯優(yōu)于其他兩種碳源(P<0.05)。酸豆奶中共鑒定出72種化合物，包括酯類17種、酸類16種、酮類15種、醇類11種、醛類4種、酚類3種、烷烴1種、烯烴1種、其他4種。不同發(fā)酵時間檢測揮發(fā)性化合物種類有差別且揮發(fā)性物質(zhì)含量存在顯著差異(P<0.05)。