不同培曲工藝對特香型大曲微生物群落結構的影響

林鈺寬，吳生文，游勇，廖昶，林培，丁忠濤，吳曉玉*

1(江西省農業微生物資源開發與利用工程實驗室，江西 南昌，330045)2(江西農業大學 生物科學與工程學院，江西 南昌，330045) 3(四特酒有限責任公司，江西 樟樹，331200)

我國白酒釀造工藝歷史悠久，并隨培曲技術的發明與改進，推動了白酒生產的規模化、規范化發展。不同白酒大曲的原料及其配比不同，但多以小麥、大麥、豌豆等為原料壓制成曲坯，入曲房自然發酵而成。大曲含有多種微生物和各種酶系，構成釀酒的內在動力；同時大曲自身所含的微生物代謝產物及原料分解產物，直接或間接構成白酒的風味物質，使白酒具有各種不同的獨特風味[1-3]，故有“曲為酒之骨”之美譽。

堆曲培養(培曲工藝)是決定大曲質量優劣的關鍵環節，堆曲方式與培曲條件的改變均對大曲質量造成不同程度的影響。李偉安等[4]采用傳統與架式2種大曲培養方式，比較兩者大曲理化指標與微生物群落結構差異，表明架式大曲更有利于細菌、乳酸菌和霉菌的生長。陳可丹等[5]分析不同頂溫的特香型大曲理化指標及微生物群落演替差異，表明中頂溫曲的酸性蛋白酶、糖化力、酯化力均高于高頂溫曲。邢鋼等[6]跟蹤測定了3種不同溫度大曲制作過程中理化指標變化，結果顯示大曲糖化力、酯化力、液化力、發酵力4項指標相差較大，其中中溫大曲最優，低溫大曲居中，高溫大曲最小。明紅梅等[7]通過提高制曲品溫來探究制曲溫度對醬香型大曲質量的影響，結果表明超高溫大曲的感官質量優于普通高溫大曲，但糖化力與酯化力明顯較普通高溫大曲更低。

特香型白酒具有“整粒大米為原料、大曲面麩加酒糟、紅褚條石壘酒窖”的工藝特征，以及“濃頭醬尾清中間、三香俱備猶不靠”的風味特點[8]。目前對特香型大曲的研究多集中在大曲理化指標及采用可培養手段對大曲進行微生物群落分析[9]，大曲制作過程中培曲方法對其微生物群落結構影響的報道較少見。本研究以特香型大曲為研究對象，研究不同培曲方法對大曲微生物群落結構的影響，以期解決前期發酵上霉過快、中后期品溫下降迅速的問題，為進一步提高特香型大曲質量提供理論與技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 大曲樣品采集

在江西四特酒有限責任公司大曲車間，取4間曲房，其中2間為常規培曲工藝(traditional culture techniques ofDaqu，TT)，2間為新培曲工藝(new culture Techniques ofDaqu，NT)，4間曲房分別于0(曲坯入房)、5、10、15、20、25 d(曲坯出房)5點取樣，粉碎后混勻、過篩，置-80 ℃冰箱貯存。

1.1.2 試驗試劑

碘、干酪素、可溶性淀粉、硫代硫酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸、乳酸、三氯乙酸、羧甲基纖維素鈉、L-酪氨酸、3,5-二硝基水楊、己酸，均為分析純，西隴科學股份有限公司；α-淀粉酶試劑盒，南京建成生物科技有限公司；Omega提取試劑盒 Mag-Bind Soil DNA Kit。

1.1.3 儀器與設備

FA2004B電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；PHS-3G雷磁電子pH計，上海精密科學儀器有限公司；TCL20M高速冷凍離心機，常州百密思儀器有限公司；HH-3數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；ZFD-5040電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械廠；T1可見光分光光度計，上海屹譜儀器有限公司；K9860全自動凱氏定氮儀、SH220 N石墨消解儀，海能儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培曲工藝

大曲原料配方、曲坯制作方法參考文獻[10]。

TT與NT的工藝區別在于：推遲曲坯覆蓋稻草及翻曲時間，詳見表1。

表1 特香型大曲不同培曲工藝蓋稻草與翻曲時間 單位：d

1.2.2 大曲理化指標及酶活力測定

大曲溫度：每天上午和下午各1次，將溫度計插入大曲約2 cm深度，隨機測定3個曲坯溫度。分別計算測定溫度平均值即為大曲溫度。

水分、酸度、酸性蛋白酶活力、纖維素酶活力、糖化力、液化力、酯化力的測定方法參考文獻[11]。

1.2.3 大曲微生物量碳、氮測定

大曲中微生物量碳、氮含量的測定采用熏蒸浸提法[12-13]。取新鮮的大曲研磨后，置于真空干燥器內用去乙醇氯仿黑暗熏蒸24 h，用0.5 mol/L硫酸鉀溶液浸提，取浸提液，抽濾(濾膜< 0.5 μm)，獲得濾液，取濾液分別用重鉻酸鉀氧化法與凱氏法測定碳、氮含量；另將不熏蒸大曲浸提、抽濾，測定濾液碳、氮含量，作為對照。

大曲微生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)與大曲微生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)測定如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：EC、EN分別為熏蒸與未熏蒸大曲浸提液有機碳、氮的差值；0.38、0.45為校正系數；詳細測定、計算方法參考文獻[14-16]。

1.2.4 大曲總DNA提取及高通量測序

樣品的前處理方法參考文獻[17]。采用Omega的提取試劑盒 Mag-Bind Soil DNA Kit提取宏基因組DNA。用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)擴增細菌核糖體16S rRNA的V3～V4區。用正向引物ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)、反向引物ITS1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增真菌核糖體ITS1。細菌、真菌擴增產物的Illumina MiSeq測序由派森諾科技有限公司(中國上海)完成。本文細菌、真菌群落測序數據已提交至NCBI SRA數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra)，登錄號為PRJNA716114、PRJNA716120。

1.2.5 數據處理

本文所有實驗設置3組重復，數據以平均值±標準差表示。采用Microsoft Office Excel 2016與R語言進行數據計算和分析；單因素ANOVA 分析理化指標間顯著性，Adonis法分析微生物群落組間顯著性，P< 0.05表示在0.05水平上具有顯著性差異；GraphPad Prism繪制折線圖、R語言繪制豐度圖、Canoco5繪制冗余分析(redundancy analysis，RDA)圖。

2 結果與分析

2.1 大曲發酵的理化指標及酶活性變化

TT和NT培曲過程中溫度變化如圖1所示，TT與NT工藝大曲品溫均呈現先上升后下降趨勢。TT

圖1 不同培菌工藝的曲房與大曲溫度變化Fig.1 Deviation of Daqu core temperature from room temperature with different culture techniques注：當日日均溫度數據源于天氣網

大曲在發酵4～9 d時，品溫較NT的上升快，高出2～6 ℃；在第3次翻曲(10 d)后，從12 d開始TT品溫較NT下降迅速，從12 d至發酵結束時較NT的品溫降低3～12 ℃。表明NT工藝可使曲坯發酵前期減緩升溫速度、后期放緩降溫速度。

大曲理化指標及酶活力變化規律如圖2所示。NT工藝大曲的纖維素酶活力、糖化力、液化力、酸性蛋白酶活力均顯著高于TT(P<0.05)，酸度低于TT，而兩者的含水量與酯化力差異不顯著。纖維素酶活力和糖化力從發酵5 d開始NT高于TT，而液化力和酸性蛋白酶活力從發酵開始后NT一直高于TT，至25 d結束分別高出63.46%、78.7%。綜上結果表明NT工藝曲的酶活力優于TT。

a-含水量；b-酸度；c-纖維素酶活力；d-糖化力；e-液化力；f-酸性蛋白酶活力；g-酯化力圖2 不同培曲工藝大曲的理化指標及酶活力變化Fig.2 Effects of different culture techniques on Daqu physicochemical indices and enzymatic activities

2.2 大曲發酵的MBC、MBN變化

大曲發酵過程中MBC、MBN動態變化如圖3所示。TT與NT的MBC、MBN差異明顯，但均在15 d時達到峰值。NT的MBC在10 d前低于TT，15 d后高于TT，表明在0～10 d期間，TT曲坯微生物生物量大于NT，并在15 d時達到最大值，15 d以后后者生物量大于前者。MBN是微生物對氮素礦化和固持作用的綜合反映[18]，由于MBN大小受微生物生物量、環境氮素等多重因素影響，NT的MBN僅在發酵結束時高于TT，提高了59%。

2.3 不同培曲工藝大曲微生物多樣性分析

為比較不同培曲工藝對大曲微生物多樣性的影響，基于Illumina HiSeq測序平臺，對TT、NT曲坯進行α多樣性評價，結果見表2。每個樣品文庫的覆蓋率(coverage)高達99.8%以上，說明此次測序結果可靠。比較各樣品的α指數發現，細菌各項α多樣性指數均表現上升趨勢，而真菌α多樣性指數則呈現先下降后升高，TT曲坯細菌的Chao1、ACE、Simpson和Shannon指數高于同期的NT，NT真菌各項指數高于同期的TT。綜上結果表明，TT的細菌豐度、多樣性高于NT，而真菌則相反，NT高于TT。

a-大曲MBC；b-大曲MBN圖3 不同培曲工藝對大曲MBC、MBN的影響Fig.3 Effects of different culture techniques on microbial carbon and nitrogen biomass in Daqu

表2 不同培曲工藝的大曲微生物群落多樣性和豐度Table 2 Effect of different culture techniques on Daqu microbial abundance and community diversity

2.4 不同培曲工藝對大曲微生物群落結構的影響

選取TT、NT細菌、真菌OTU總數前10的序列，繪制物種(屬水平)相對豐度柱狀圖，如圖4-a、圖4-b所示。NT和TT大曲的優勢細菌屬無顯著性差異。魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacilus)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和片球菌屬(Pediococcus)是整個發酵過程優勢菌(圖4-a)。其中，Weissella在第0天占據主導地位(相對豐度83.46%)，第20天時TT降低至23.8%，NT降低至13.34%；Lactobacilus在0 d時相對豐度為2.2%，隨后逐漸成為主要優勢菌屬，尤其在NT第10天相對豐度達到66.9%，20 d降至53.62%，TT中分別為19.28%和16.76%；Acetobacter在NT中由第10天相對豐度20.5%降到20 d的4.2%，而在TT中由10 d相對豐度0.047%升高到20 d的4.86%。

TT與NT發酵過程中優勢真菌屬群落間差異顯著。其中嗜熱子囊菌(Thermoascus)、曲霉(Aspergillus)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)為NT、TT大曲的優勢真菌(圖4-b)。絲孢畢赤酵母(Hyphopichia)和假絲酵母(Candida)在第0天時占據主導地位，相對豐度分別為68.2%和15%，隨后不斷降低，20 d 時在NT中的相對豐度分別為2.1%、5.5%，而在TT大曲中僅為0.3%、0.2%。值得注意的是，Thermoascus是TT大曲發酵中后期的主要優勢真菌，10 d時相對豐度達到95.72%，20 d時降至26.7%；在NT 10 d時僅為0.3%，20 d時提升至22.7%，是NT大曲后期的主要優勢真菌。Aspergillus、Rhizomucor、Rhizopus

a-細菌屬水平；b-真菌屬水平；c-細菌群落PCoA；d-真菌群落PCoA圖4 不同培曲工藝大曲微生物群落結構及PCoAFig.4 Microbial community structure and PCoA of Daqu produced with different culture techniques

在第0天相對豐度分別為0.08%、0.01%、0.1%，并隨著發酵進行逐漸成為優勢菌。Aspergillus在發酵第20天 時相對豐度分別為TT 68.1%、NT 39.6%，是2種大曲發酵后期的主要優勢真菌。Rhizomucor、Rhizopus則主要在NT大曲中占據主導地位，第20天時相對豐度為50.6%與13.8%(NT)遠高于TT大曲第20天時相對豐度3.6%與0.8%(TT)。

基于Weighted UniFrac距離主坐標分析(principal coordinates analysis,PCoA)(圖4-c、圖4-d)，細菌群落結構的第一主成分得分為64.97%，第二主成分得分為26.97%，前2個主成分積累得分91.94%(解釋度大于50%)，故可基于圖4-c分析樣品之間細菌群落差異。0 d時細菌群落結構與TT、NT的10 d、20 d差異顯著，而TT與NT細菌群落間無明顯差異，但TT 10 d與TT 20 d、NT 10 d與NT 20 d的細菌群落結構更相近。對于真菌群落結構，第一主成分得分48.63%，第二主成分得分為35.22%，前2個主成分積累得分83.85%，解釋度大于50%。樣品0 d、TT與NT三者之間差異顯著，其中TT 10 d與TT 20 d傾向聚為一簇，而NT 10 d與NT 20 d間并沒有明顯的成簇。

2.5 大曲微生物群落與環境因子、大曲理化指標間的RDA

將大曲樣品中主要細菌屬、真菌屬與大曲的糖化力、液化力、酯化力、纖維素酶活力、酸性蛋白酶活力5個酶活力及酸度、含水量、品溫、曲房溫度4個理化指標進行RDA，如圖5所示。

如圖5-a所示，第一與第二主軸分別解釋了主要優勢細菌相對豐度變化的86.11%和8.28%，總解釋度為94.39%，圖5-b中，第一與第二主軸分別解釋了主要真核生物群落相對豐度變化的46.16%與28.9%，總解釋度為75.06%，說明微生物在屬水平上的分布與理化指標及酶活力之間關系密切。

大曲酸度、品溫、曲房溫度的變化與Lactobacilus、Acetobacter、Bacillus、Thermoascus、Aspergillus、Rhizomucor和Rhizopus呈正相關，與Weissella、Hyphopichia和Candida呈負相關；而含水量與上述菌群的相關性和酸度、品溫等的相反(圖5)。酸性蛋白酶活力和液化力主要與細菌屬Lactobacilus、Acetobacter呈正相關；在真菌屬中Aspergillus、Rhizopus與酸性蛋白酶活力呈正相關，液化力主要與Candida、Rhizopus和Hyphopichia呈正相關。酯化力、糖化力主要與細菌屬Weissella及真菌屬Hyphopichia、Candida呈正相關；纖維素酶活力主要與細菌屬Weissella呈負相關、與真菌屬Aspergillus、Rhizopus呈正相關。

a-細菌群落；b-真菌群落圖5 大曲微生物群落與酶活力、理化指標冗余分析Fig.5 Redundancy analyses between microbial community and enzyme activity and physicochemical indices in Daqu注：優勢菌群為藍色線、酶活力為紅色線、理化指標為綠色線

3 討論

為解決特香型大曲前期發酵上霉過快、中后期品溫下降迅速的問題，本文采取NT，即延遲覆蓋稻草和推遲翻曲時間。與TT相比，發酵前期NT工藝推遲1 d覆蓋稻草、僅翻曲1次，減緩了品溫上升速度；發酵后期NT再經歷第2、3次翻曲，減緩了品溫下降速度，高溫期得到延長，而曲坯后期堅挺的品溫有利于曲香生成[19]。

微生物量碳氮常作為土壤微生物生物量及土壤肥力的檢測指標[20]，本文首次嘗試將該檢測方法用于大曲的微生物生物量分析。由于NT品溫前期低于TT，微生物量碳、氮均低于TT，但在15 d后發生逆轉，微生物生物量高于TT。即NT較TT前期微生物生長減慢，后期生長優于TT。

培曲工藝調整后，微生物多樣性及群落結構出現明顯變化。NT的真菌豐度、多樣性高于TT，而細菌則相反，TT高于NT。0 d時因曲坯制作過程中添加丟糟，Weissella、Hyphopichia和Candida占據主導地位，隨后NT在10 d時Lactobacilus、Aspergillus、Hyphopichia和Rhizopus相對豐度高，而TT則是Weissella、Lactobacilus、Thermoascus相對豐度高，特別是Thermoascus高達95.72%，推測與品溫關系密切，此時TT正處于高溫發酵階段。在20 d時，NT中的真菌是Thermoascus、Rhizomucor、Rhizopus相對豐度偏高，TT是Thermoascus、Aspergillus偏高。

LI等[2]發現微生物群落替代與白酒發酵過程中物理化學參數的變化密切相關。有研究表明Candida具有分泌酯酶的能力[21]；Hyphopichia存在于傳統發酵中，是酵母屬的一種具有產香氣的能力，對發酵產品風味的形成有潛在的作用[22-23]；酸性蛋白酶活力與Aspergillus、Rhizopus與呈正相關[24]。NT的酸性蛋白酶活力在發酵10～15 d達到最大值，隨后下降，而TT從10 d開始下降，20 d后上升，其變化趨勢與Aspergillus、Rhizopus菌群相對豐度的變化趨勢一致。大曲的液化力主要與Lactobacilus、Acetobacter、Candida、Rhizopus、Hyphopichia呈正相關，這與NT大曲在10 d時上述菌群相對豐度顯著高于TT有關。據報道Bacillus是醬香大曲的核心菌群，同樣也存在于特香型大曲中，其主要功能是產生蛋白水解酶、淀粉酶、有機酸等[19,25]，它與溫度、酸度呈正相關而與水分呈負相關，具有抵抗和耐受熱、酸、干旱等能力[26-27]。Lactobacilus被認為是一種專性異養發酵屬，是谷物發酵中所必需的屬[28]，也是濃香型白酒發酵中的標志微生物[29]。上述這些屬被認為是具有降解功能的群體，可以生產各種水解酶和香味物質[30]。NT大曲在纖維素酶活力、糖化力、液化力、酸性蛋白酶活力均顯著高于TT工藝的大曲，與微生物生物量、微生物群落結構不同于TT有關。

4 結論

本研究通過調整特香型培曲工藝，使大曲發酵過程中曲溫呈現前緩、后堅挺，大曲微生物多樣性及群落結構發生改變。NT大曲的優勢真菌種類與相對豐度較常規大曲更為豐富與均衡，纖維素酶、酸性蛋白酶、液化力、糖化力均高于后者。本研究結果有利于推動培曲工藝的技術升級及大曲質量提高，為特香型白酒釀造控制工藝提供理論參考。