頂空固相微萃取-氣質聯用法對不同多效價復合配方栽培香菇子實體揮發性風味成分分析

羅小葉，趙皓靜，班世棟，王曉丹*

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

香菇(Lentinusedodes)又名香覃、冬菇，分類學地位為擔子菌亞門、傘菌綱、傘菌目、側耳科，小香菇屬[1-2]。我國香菇資源豐富，并且已有800多年的人工栽培歷史，是世界上香菇生產第一大國[3]。隨著產業化栽培技術的迅速發展，香菇已成為世界上第二大食用菌栽培品種，其獨特的風味和廣譜藥理作用使其被大量的食用[4]。風味主要包含鮮味和香味兩方面，香菇的鮮味，主要是由于存在谷氨酸，天冬氨酸和5′-核苷酸，尤其是5′-GMP、5′-IMP、5′-AMP和5′-XMP等小分子物質[5]。香味則大部分由醇類、酮類、醛類、酯類、醚類、烷烴類和烯烴類等7種揮發性物質組成，其中醇類包括揮發性八碳化合物如1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-辛烯-2-醇等是香菇最重要的香味物質，典型的1-辛烯-3-醇具有濃郁的蘑菇特有風味[6]。醚類中含硫化合物如二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚等也是香菇風味的重要組成成分，通常能影響香菇的整體風味[7]。此外，香菇的風味在感官屬性和消費者接受度方面起著重要作用[8]。然而，食品中香味物質的含量非常低，一般在μg/L水平[9]，因此對分析和檢測技術要求較高。頂空固相微萃取-氣質聯用(headspace solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)技術是經過萃取、解析過程，再結合氣相色譜-質譜聯用儀，利用固相萃取吸附幾何微區效應的一種提取分離檢測技術，常用于檢測食品香氣或揮發性成分，并且在揮發性成分的分析和鑒定方面效果十分理想[10-11]。它集頂空固相微萃取、氣相色譜安全、準確、分離能力強和質譜鑒定物質的優勢于一體[12]。

安龍縣是貴州省食用菌產業發展示范縣，該縣通過發展現代山地農業示范園區與易地扶貧搬遷相結合，致力于打造“中國最大優質夏菇生產基地”、“中國西南菌都”、“食用菌硅谷”和“中國香菇第一村”，以實現農村貧困人口脫貧致富。但是，安龍縣食用菌產業在持續發展中存在著生產香菇品質不高等問題。培養料是生產香菇的物質基礎，其對香菇的風味品質至關重要。菜籽餅營養豐富，其中粗蛋白含量較高，氨基酸組成均衡，是一種優質的植物蛋白，適量添加菜籽餅可以提高香菇的品質和產量[13-14]。本研究對添加不同含量菜籽餅的多效價復合配方栽培的香菇，采用固相微萃取法提取其子實體中揮發性物質，再用氣相色譜和質譜進行風味物質分析，目的是為香菇品質的提高提供理論支持，促進該地區香菇產業鏈延伸和產品高質量發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用香菇栽培種由貴州安慶菌農業科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

電子天平，上海菁海儀器有限公司；HP6890/5975C氣相-質譜聯用儀，美國Agilent公司；手動固相微萃取裝置、2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多效價復合配方香菇子實體栽培色譜條件

食用菌栽培基質最重要的2種成分為碳元素和氮元素，其中碳氮比對子實體的生長具有重要的調控作用[15]。食用菌對栽培料碳氮比的要求通常在營養生長階段, 即菌絲體生長階段，要求氮含量偏高, 碳氮比一般以20∶1為佳；子實體生長發育階段，要求氮含量所占的比例偏低，碳氮比以30～40∶1較優[16]。本實驗以企業常規栽培配方(木屑78%、麩皮20%、石膏1%、糖1%，質量分數)為對照，設置添加不同比例含量的菜籽餅代替麥麩栽培香菇，共設置5個配方，代替比例及各配方組成和配比見表1，每個栽培配方設3次重復，生產方法采用香菇常規生產方法。

生產流程：

備料→配料→裝袋→滅菌→冷卻→接種→菌絲培養→脫袋排場→轉色管理→變溫催菇→出菇管理→采收

表1 多效價菌棒復合配方Table 1 Compound formulas of multi-titer fungus sticks

1.3.2 檢測方法

提取方法：準確稱取5 g鮮香菇丁(去除菇柄)，置于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中，熱解析7 min進樣。

色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度：38 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升溫至176 ℃，以6 ℃/min升溫至260 ℃；載氣：He；流量：1.0 mL/min；不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊離子源(electron impact，EI)；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；倍增器電壓1 812 V；質量掃描范圍29～500 u。

1.3.3 揮發性成分定性與定量方法

各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist 2017和Wiley275標準質譜圖，對揮發性化學成分進行鑒定，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數[17]。

1.4 數據處理

所有數據均進行3次重復試驗。采用Excel 2010軟件對數據進行統計制表，SPSS 21.0對特征風味成分進行主成分分析和聚類分析，Origin 2018用于圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 香菇揮發性風味成分鑒定及在不同復合配方中的差異

由圖1、圖2可知，通過HS-SPME-GC-MS從6種不同復合配方栽培香菇子實體中共檢測出醇類、醛類、酮類、酯類、醚類、烷烴類、烯烴類等55種揮發性風味成分，其中包括13種醇類物質、13種醛類物質、5種酮類物質、5種酯類物質、4種醚類物質、10種烷烴類物質、5種烯烴類物質。不同復合配方栽培香菇子實體中相對含量最高的風味成分均為1-辛烯-3-醇，分別為52.0%、53.7%、59.1%、58.9%、58.2%和55.1%。根據不同復合配方中對香菇風味重要的揮發性物質種類和含量相比較發現，由于菜籽餅營養豐富，適量的添加可使香菇的風味物質增加，復合配方3和復合配方4中揮發性成分均多于50種，高于常規配方的48種風味物質。其中，復合配方3栽培香菇子實體的揮發性風味成分含量最高，并且對香菇風味組成重要的醇類和醛類揮發性物質的含量也均為最高，分別為81.4%和2.2%。但菜籽餅含有硫甙、植酸等抗營養因子，且其油性較大，會影響香菇菌絲對培養基養料及水分的吸收，不利于揮發性風味成分的積累，復合配方1和復合配方2分別為40種和45種風味物質，重要的醇類和醛類物質分別為63.3%、0.9%和65.8%、1.0%，均比其他復合配方及常規配方的含量低。復合配方5與常規配方較為接近，菜籽餅代替比例僅為2%，因此2個配方所生產香菇子實體的重要的醇類和醛類揮發性物質種類和含量也較為接近，分別為47種、72.4%、1.8%和48種、72.9%、1.5%，說明菜籽餅添加量較少，對重要揮發性物質的影響也較小。

香菇的揮發性物質主要為八碳化合物和含硫化合物，其中，1-辛烯-3-醇是香菇最具代表性的八碳化合物，又稱蘑菇醇；1,2,3,5,6-五硫雜環庚烷，又稱香菇精，是一種揮發性環狀含硫化合物，香菇香味的主要呈味成分之一，香味強烈并且特征性強[18]。各配方香菇1-辛烯-3-醇的相對含量排序為：配方3>配方4>配方5>常規配方>配方2>配方1;1,2,3,5,6-五硫雜環庚烷的相對含量排序為：配方2>常規配方>配方5>配方3>配方1>配方4。配方3中1-辛烯-3-醇的相對含量最高為59.1%，比常規配方提高了7.2%，但1,2,3,5,6-五硫雜環庚烷的相對含量為0.6%，比常規配方降低了11.5%；配方1和配方2中1-辛烯-3-醇的相對含量分別為52.0%、53.7%，均低于其他復合配方及常規配方，然而配方2中1,2,3,5,6-五硫雜環庚烷的相對含量最高為0.7%；配方4中1,2,3,5,6-五硫雜環庚烷的相對含量最低為0.3%，低于常規配方的54.1%。如圖3所示，綜合2種揮發性物質的總含量來看，配方3揮發性物質含量相對較高，說明菜籽餅的替代比例為10%更利于香菇子實體風味物質的積累。

圖1 不同復合配方栽培香菇揮發性風味成分種類及相對含量Fig.1 Types and relative contents of volatile flavor components in Lentinus edodes cultivated with different compound formulations

圖2 不同復合配方栽培香菇揮發性風味成分比較Fig.2 Comparison of volatile flavor components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

圖3 不同復合配方栽培香菇2種主要揮發性風味物質比較Fig.3 Comparison of two main volatile flavor compounds of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

2.2 不同復合配方香菇揮發性風味成分主成分分析

成分分析是一種多元統計技術，將原始的相關變量轉化為一組新的不相關變量，其目的是在降維空間中提取最大的數據方差，主成分分析累計貢獻率越大，越能反映樣品的信息[19-20]。本試驗以6種不同復合配方香菇的7種關鍵揮發性風味成分進行主成分分析，綜合評價不同復合配方香菇的風味品質差異[21-23]。

2.2.1 揮發性風味成分主成分評價模型的構建

以特征值大于1為標準，對7種風味成分降維進行主成分分析，得到各主成分特征值、貢獻率及累計貢獻率，如表2所示。選取前3個主成分，其累計方差貢獻率達89.1%(>85%)，包含了不同復合配方香菇揮發性風味成分的絕大部分信息，符合主成分分析要求[24]。結合表3主成分特征向量與荷載矩陣可得，前3個主成分中，第一主成分的方差貢獻率為43.1%，決定第一主成分的主要是醇類、醛類、酯類及烷烴類物質。第二主成分的方差貢獻率為24.2%，決定第二主成分的主要是醇類、醛類、酮類、醚類及烷烴類物質。第三主成分的方差貢獻率為21.8%，決定第三主成分的主要是醇類、酮類、酯類、醚類、烷烴類及烯烴類物質。此外，荷載還能反映各變量與主成分間的相關系數，且絕對值數值越大，相關性越強[25-26]。由于各主成分反映的變異信息存在重合性，因此結合各主成分間的變異信息與主成分間的相關性，將7類風味物質的變異信息分為3組，第一主成分主要反映醇類及醛類物質的變異信息，第二主成分主要反映酮類、醚類及烷烴類物質的變異信息，第三主成分主要反映酯類及烯烴類物質的變異信息

表2 主成分的特征值、貢獻率及累計貢獻率Table 2 Eigenvalues, contribution rates and accumulative contribution rate of principal components

2.2.2 基于主成分評價模型的風味品質的比較

根據表2、表3，建立復合配方栽培香菇風味品質的評價模型，得出各主成分得分與各揮發性風味成分間的線性關系式為[27-29]：

F1=0.300X1+0.274X2-0.123X3+0.208X4-0.219X5+0.187X6-0.159X7

F2=0.051X1+0.160X2+0.502X3-0.171X4+0.306X5+0.360X6-0.240X7

F3=0.228X1-0.154X2+0.182X3+0.470X4+0.225X5+0.148X6+0.502X7

表3 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 3 Principal component eigenvectors and loading matrix

可以利用前3個主成分新的綜合指標來替代原始的多個指標進行分析。以不同特征值的方差貢獻率βi(i=1，2，…，k)為加權系數，利用綜合評價函數F=β1F1+β2F2+…+βkFk，建立不同復合配方栽培香菇綜合風味品質的評價模型：F=0.430 92F1+0.241 84F2+0.218 35F3。其中F1為第一主成分得分，F2為第二主成分得分，F3為第三主成分得分，得分值越高，表示該主成分對不同復合配方栽培香菇的風味貢獻越大。根據不同復合配方栽培香菇的風味評價綜合得分值見表4，該得分值可反映不同復合配方栽培香風味品質的差異。

表4 不同復合配方栽培香菇主成分綜合得分Table 4 Comprehensive scores of principal components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

由表4可知，復合配方4栽培香菇的第一、第三主成分得分較其他復合配方和常規配方高，反映出醇類、醛類、酯類及烯烴類物質對該復合配方栽培香菇樣品的風味物質貢獻較大；復合配方2栽培香菇的第二主成分得分最高，充分反映出酮類、醚類及烷烴類物質對該復合配方栽培香菇樣品的風味物質貢獻較大。因此，復合配方4栽培香菇受醇類、醛類、酯類及烯烴類物質的影響較大，復合配方2栽培香菇受酮類、醚類及烷烴類物質的影響較大。6種不同復合配方栽培香菇風味品質從高到低綜合排名依次為復合配方3(F=15.841)、復合配方4(F=15.831 0)、復合配方5(F=15.678 3)、常規配方(F=15.782 6)、復合配方2(F=14.971 8)、復合配方1(F=13.192 5)，表明在該主成分評價模型下，不同復合配方栽培香菇風味品質差異明顯，且復合配方3栽培香菇風味品質最佳。

2.2 不同復合配方香菇揮發性風味成分聚類分析

聚類分析是將樣品對象的集合分組為類似的對象組的多個類的分析過程。如圖4所示，在歐式距離為5時，將5種復合配方和常規配方分為三類，各風味成分相對含量詳見表5。復合配方1單獨組成第一聚類，占總配方的16.67%，這一聚類的主要特點是風味品質適中。復合配方2單獨組成第二聚類，其主要特點是酮類、醚類和烯烴類物質含量較高。復合配方3、復合配方4、復合配方5和常規配方共同組成第三聚類，占總配方的66.67%，這類群的醇類、醛類、酯類和烷烴類物質含量較高。復合配方1和復合配方2中重要揮發性物質低于其他配方，說明菜籽餅添加量過多會影響醇類和醛類等重要揮發性風味物質的積累。

圖4 不同復合配方栽培香菇風味成分系統聚類分析Fig.4 Systematic cluster analysis of the flavor components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

表5 復合配方栽培香菇3個聚類的7種風味物質平均值Table 5 Average values of seven flavor substances in three clusters of Lentinus edodes cultivated with compound formulas

3 結論

本研究運用頂空固相微萃取-氣質聯用技術對香菇子實體風味成分進行檢測，共鑒定出55種揮發性風味物質，且各配方中1-辛烯-3-醇含量均最高，分別為52.0%、53.7%、59.1%、58.9%、58.2%和55.1%。不同比例的菜籽餅替代麩皮的多效價復合配方對栽培的香菇子實體風味成分均有影響，綜合1-辛烯-3-醇和1,2,3,5,6-五硫雜環庚烷的總含量來看，配方3揮發性物質含量相對較高；主成分分析選出3個代表89.1%樣品信息的主成分來說明樣品之間的差異，其中代替比例為10%、5%的多效價復合配方風味成分種類和含量比常規配方高；聚類分析也發現配方1和配方2中醇類、醛類、酯類和烷烴類物質低于其他復合配方和常規配方。對于替代比例僅為2%的配方5，香菇子實體的重要揮發性物質種類和含量為47種和86.3%，與常規配方的48種和86.9%相接近。綜合比較后得出復合配方3整體風味品質最佳。本實驗通過分析比較不同多效價復合配方和常規配方栽培香菇子實體的風味成分，為香菇栽培配方的改良和品質的提高提供理論基礎，對安龍縣食用菌產業的發展具有重要意義。