采用實時熒光定量PCR法檢測白酒釀造系統中的重要功能菌株Lactobacillus jinshani

張媛，廖衛芳，繆禮鴻*，楊團元，劉蒲臨，楊一斌

1(武漢輕工大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢，430023)2(湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北 松滋，434200)

白酒是由多種微生物相互作用共同代謝生產的[1]。白酒釀造過程中的微生物主要可分為細菌、酵母和霉菌3大類，白酒發酵過程中這些微生物相互影響一起發揮重要作用。乳酸菌是白酒發酵過程中的優勢菌種，其種類和數量的變化對白酒釀造過程至關重要[2-3]。乳酸菌既能代謝產生酸類、醛類等物質直接影響白酒風味，也能通過產生淀粉酶、酯化酶等影響白酒的出酒率和香味[4-5]。與其他菌種的相互作用方面，乳酸菌產生的乳酸、乙酸等有機酸和細菌素等拮抗物質可以影響其他微生物的生長[6-8]，而其也能夠通過乳糖酶將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，為酵母生長提供碳源[9]。乳酸菌作為白酒釀造過程中的優勢菌群在白酒釀造過程中發揮著重要的作用，研究白酒發酵過程中乳酸菌分布特征及消長變化對于指導白酒生產有重要意義。

傳統的檢測方法是使用不同的選擇性培養基對微生物進行培養分離, 但卻不能及時反映一般條件難以分離培養的微生物的種類和數量變化。現在多種分子生物學技術手段被應用于食品中乳酸菌的定量[10]。實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，q-PCR)技術通過設計特異性引物有效地檢驗樣本中的目標微生物，該方法靈敏、快速，廣泛應用于食品微生物的檢驗中[11-13]。GUO等[14]和包秋華等[15]利用q-PCR檢測研究了發酵乳中嗜酸乳桿菌，牛犇等[16]將傳統方法q-PCR方法進行比較，發現q-PCR法可快速、高效地檢測實際食品基質中的微生物。為了快速有效地分析和檢測復雜微生態環境中的乳酸菌, q-PCR技術以其較高的可重復性、靈敏性以及準確性在微生物定量以及乳酸菌定量研究領域得到廣泛應用[17-18]。

Lactobacillusjinshani是從中國白酒釀造系統中分離出的釀造微生物。YU等[19]首次從鎮江香醋固態發酵過程中分離到1株革蘭氏陽性、具有異型乳酸發酵特性的兼性厭氧菌株HSLZ-75T并命名為金山乳桿菌L.jinshani。DU等[20]根據L.jinshani分布頻率高、相對豐度高的特點，將L.jinshani作為內標。用種特異性引物定量測定了內標物的絕對豐度后，用內標物歸一化方法研究了發酵后的細菌群落及其動態。通過對乳酸菌的定量微生物群分析，確定乳酸菌是一種關鍵的風味物質產生菌，與8種風味物質相關。邢敏鈺等[21]通過高通量測序發現L.jinshani是白酒釀造中后期優勢微生物，并且通過相關性分析發現該菌與其他微生物呈負相關，其含量與產出原酒質量正相關，在發酵過程中扮演著重要角色。本研究根據L.inshani的全基因組序列設計特異性引物，建立了L.jinshani的q-PCR檢測方法。該方法可快速有效的對L.jinshani進行鑒定，為研究其在白酒釀造系統中的演替及所發揮的功能奠定了堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

本研究所用菌株均由本實驗室從酒醅中分離獲得，冷凍干燥后保藏于-80 ℃冰箱，包括L.jinshani在內的13種微生物分屬5個屬。實驗所用酒醅均由湖北白云邊酒業股份有限公司提供。

1.1.2 試劑和儀器

EB-溴乙錠，國藥集團化學試劑有限公司；PCR引物(27F、1492R)，上海生工生物工程技術服務有限公司；TaqDNA聚合酶、DL 2 000 DNA marker，大連寶生物公司。

電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；BIO-RAD T100 PCR儀，聯想生物技術有限公司；超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；自動凝膠成像分析系統，美國Syngene公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

微生物純培養物基因組DNA提取：收集處于穩定期的菌體，取1 mL于1.5 mL EP管中，離心收集菌體，按照DNA抽屜試劑盒步驟提取DNA。

酒曲及酒醅樣本基因組DNA 提取：

(1)將50 g的樣品與100 mL的抽提緩沖液放入燒杯中充分混合之后放入全溫振蕩機，4 ℃，180 r/min，振蕩30 min，置入離心設備，中速離心5 min，濾除上層液體，留下底部沉淀。

(2)將沉淀放于燒杯內然后加入500 mL抽提緩沖液，混勻后，放于液氮中冷凍然后解凍融化，得到含目標的微生物體系。

(3)將目標微生物和10 μL 100 mg/mL溶菌酶和20 μL 200 mg/mL溶壁酶放入1.5 mL無菌EP管中混勻，然后放入全溫振蕩機37 ℃、180 r/min孵育1 h。

(4)加入60 μL 20%的十二烷基硫酸鈉，30 μL 5%的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)/NaCl和100 μL 5 mol/L NaCl，混勻后放入水浴鍋中65 ℃水浴1 h；接著置入離心設備，恒溫4 ℃中高速完成離心操作。

(5)靜置分層后，取上層液體置入小于3 mL的離心管中，加入等量的苯類、酚類混合型物質溶液后進行離心操作，向原玻璃容器中加入0.1體積的，濃度為3 mol/L且pH值為5～7的乙酸鈉溶液和2倍體積的無水乙醇溶液，攪拌后置于冷凍設備1 h。

(6)將裝入溶液的離心管放入差速離心機內，高轉速離心10 min，取出沉淀物置于干凈的試管中，用體積分數為90%的醫用酒精清洗沉淀，重復2次后恒溫干燥，最后加入30 μL ddH2O溶解化合物的DNA，置于冷凍設備保存。

1.2.2 引物設計

通過Nr數據庫對L.jinshani的全基因序列(GenBank 登錄號為CP034726.1)進行系統的比對分析，選擇了L.jinshani特有的單拷貝基因為目的基因，使用NCBI primer-blast設計特異性引物。

1.2.3 PCR 體系和條件

PCR反應體系(50 μL)：2×PowerTaqMaserMix 25 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，三蒸水 22 μL。

PCR擴增16S rDNA，采用乳桿菌16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)與1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)

PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。

q-PCR反應體系(20 μL)：AceQ Universal SYBR Green q-PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.2 μL，模板1 μL，補充ddH2O 至20 μL。

q-PCR的反應條件[22]：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，40個循環。溶解曲線均設定為從65 ℃升溫至95 ℃，每增加0.5 ℃ 檢測1次熒光信號強度，每次檢測持續5 s。每次檢測均含有3個技術平行。

1.2.4 有效性和特異性

使用含有L.jinshani的質粒、純種L.jinshani基因以及含有L.jinshan.的酒醅基因組作為陽性對照，選擇白酒釀造系統中常見12種非目標微生物的基因組作為陰性對照，通過PCR驗證引物的有效性和特異性。根據陽性對照組擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果判斷引物的有效性；將PCR 擴增產物送至蘇州金唯智生物公司測序，根據測序結果判斷引物擴增產物的特異性；根據陰性對照組擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果判斷對于其他微生物的特異性。

1.2.5 載體的構建

利用設計的特異性引物，以酒醅樣本基因組 DNA 為模板進行目標片段的擴增，取5 μL PCR 產物在1.5%含有染色液EB的瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增結果。目標片段經膠回收后與pMD19-T載體連接，利用質粒抽提試劑盒抽提質粒，使用特異性引物擴增測序驗證是否轉化成功。將已完全形成的質粒作為標樣，采用蛋白核酸檢測定量儀器來驗證所測質粒的濃度大小，最后根據檢測標準符合度，進行冷藏保存。

1.2.6 標準曲線的構建

構建好的質粒標準品以10倍稀釋梯度進行稀釋，共制備-1～-7共7個稀釋梯度。以原始濃度和經過稀釋的質粒標準品作為模板進行q-PCR，測定對應的Cq值，構建質粒拷貝數與Cq值之間的線性關系，繪制標準曲線。擴增效率E計算如公式(1)所示：

(1)

式中：E，擴增效率；a，標準曲線的斜率。

1.2.7 重復性檢驗

以10倍梯度稀釋1.2.5中質粒樣本，以稀釋104倍～107倍的樣本為q-PCR檢測模板測定對應的Cq值，每個稀釋度3次重復，計算Cq值的變異系數，對q-PCR檢測方法的重復性進行評價。

1.2.8 q-PCR及高通量測序檢測酒曲及酒醅中的L.jinshani

以釀造過程中酒曲及不同輪次的酒醅基因組DNA作為模板進行q-PCR檢測，根據標準曲線計算出核酸濃度，樣品中L.jinshani的含量計算如公式(2)所示。每次陽性對照選擇L.jinshani純種DNA，陰性對照選擇無菌水，保證熒光定量PCR檢測結果的準確性。

(2)

式中：K，拷貝數，copies/mL；ρ，標準品質量濃度，g/mL；MW為相對分子質量，Da。

同時將酒曲及酒醅基因組DNA送至武漢華大醫學檢驗所有限公司，對擴增子片段進行高通量測序，分析結果中可操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，得到L.jinshani在樣品細菌菌落中的百分比。

2 結果與分析

2.1 引物的設計

為構建q-PCR快速定性及定量檢測方法，對L.jinshani的全基因序列(GenBank 登錄號為CP034726.1)進行系統的比對分析，選擇了L.jinshani特有的單拷貝基因為目的基因，如圖1所示，使用NCBI primer-blast設計的特異性引物為：上游引物F:5′-TGCCACAAGGCTATCACCTC-3′, 長度為20 bp，(G+C)mol%為57.75%；下游引物R:5′-AACTCTTGGCTTCGCTGACG-3′, 長度為20 bp，(G+C)mol%為60.95%。擴增的PCR產物長度為226 bp，上下游引物不存在成環、發夾等結構，將此特異性引物進行blast比對結果如圖2所示，對目標片段具有特異性，可用于后續q-PCR檢測方法的構建。

圖1 L.jinshani擴增目標基因片段Fig.1 L.jinshani amplification of target fragment gene

圖2 特異性引物blast比對結果Fig.2 Blast comparison of specific primers

2.2 PCR檢測引物特異性

使用2.1中設計的L.jinshani特異性引物對15種不同的樣品進行PCR擴增，使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增引物，結果如圖3所示，泳道1到泳道12在266 bp處未出現特征條帶，結果顯示為陰性，表明該引物對其他12 種微生物無交叉反應；泳道13、泳道14和泳道15在266 bp處出現特征條帶，結果為陽性，均為已知含有L.jinshani目標片段的樣品相符。結果表明使用該引物擴增僅能特異性擴增出含有L.jinshani基因片段的樣品，說明該引物特異性良好，能夠對樣品中的L.jinshani進行特異性檢測。

M-2 000 bp DNA marker；1-Lactobacillus buchneri；2-Lactobacillus pontis；3-Lactobacillus casei；4-Lactobacillus farraginis；5-Lactobacillus plantarum；6-Lactobacillus parafarraginis；7-Lactobacillus panis；8-Bacillus oleronius；9-Bacillus circμLans；10-Acetobacter pasteurianus；11-Pediococcus pentosaceus；12-Saccharomyces cerevisiae；13-含有L.jinshan的質粒；14-L.jinshan.；15-含有L.jinshan.的酒醅；16-ddH2O圖3 PCR驗證引物特異性Fig.3 Validating primer specificity by PCR

2.3 q-PCR檢測引物特異性

用2.2中的12種非L.jinshani的菌種DNA樣品及L.jinshani的菌株DNA樣品分別作為模板，利用特異性引物分別進行q-PCR。結果如圖4所示，只有L.jinshani菌株組出現了擴增曲線，其他12種菌種均未出現擴增曲線，對其他12 種微生物無交叉反應，結果表明該引物在q-PCR方法上也具有良好的種間特異性，可用于區分L.jinshani與其他微生物。

圖4 L.jinshani與對照菌株的q-PCR的檢測結果Fig.4 q-PCR detection results of L.jinshani and control strains

2.4 標準曲線

回收的標準質粒質量濃度為135.26 ng/μL，將構建好的質粒標準品以10 倍稀釋梯度進行稀釋，共制備-1～-7共7個稀釋梯度。各濃度梯度質粒樣本的稀釋曲線均為平穩光滑的S 型，如圖5所示，最低檢出量為3.08×103copies/μL；如圖6所示，以不同濃度標準品拷貝數的對數作為橫坐標，以q-PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數(Cq)為縱坐標，繪制標準曲線為y=3.354x+10.613，標準曲線的斜率為-3.354，線性R2=0.99，通過斜率計算擴增效率為98.7%，滿足標準曲線的要求，可應用于實驗和實際生產。

圖5 重組質粒梯度的10倍梯度稀釋擴增曲線Fig.5 The amplification curve of serial 10-fold dilutions of recombinant plasmid

圖6 L.jinshani 目的基因拷貝數與Cq值之間的標準曲線Fig.6 The standard curve between L.jinshani target fragment gene copies number and Cq value

2.5 重復性檢驗

以2.4中的質粒為擴增模板將構建好的質粒標準品以10倍稀釋梯度進行稀釋，共制備-3～-7共5個稀釋梯度。研究特異性引物qPCR定量方法的可重復性。結果如表1所示，Cq值的變異系數(coefficient of variation,CV)在0.61%～3.06%，在每個稀釋梯度樣本的檢測結果中均有良好的重復性，證明基于特異性引物構建的q-PCR定量方法具有重復性，適用于定量含有不同濃度L.jinshani的樣本。

表1 q-PCR定量檢測方法的重復性Table 1 The reproducibility of q-PCR

2.6 酒曲及酒醅中L.jinshani含量的檢測

如表2所示，通過L.jinshani特異性引物q-PCR的方法定量檢測湖北酒廠中酒曲及不同輪次酒醅發現。酒曲中L.jinshani含量較低無法檢測到其含量，第1輪次中L.jinshani含量較低無法檢測到其含量，在第2輪次酒醅中L.jinshani含量達到(8.9±0.11)lgcopies/g，在第4輪次酒醅中L.jinshani含量達到(9.38±0.11) lgcopies/g，第5輪酒醅中L.jinshani含量達到(9.43±0.11)lgcopies/g。通過高通量檢測分析發現，酒曲中未檢測出L.jinshani，1輪酒醅中L.jinshani含量為9.05%，2輪酒醅中L.jinshani含量為81.51%，4輪酒醅中L.jinshani含量為99.71%，5輪酒醅中L.jinshani含量為99.47%。q-PCR檢測與高通通量檢測得到不同輪次酒培的L.jinshani含量相對應。從結果可以看出，L.jinshani在白酒發酵后期數量迅速增長，成為后期產優質原酒的酒醅中的優勢菌種。

表2 不同樣品中L.jinshani含量Table 2 The content of L.jinshani in different samples

3 結論與討論

L.jinshani被發現廣泛存在于全國各產區白酒釀造體系中[22]。根據本研究結果，酒曲中并未發現L.jinshani，其來源可能為釀酒過程中的其他途徑。白云邊第1輪酒醅中L.jinshani出現的比率很小，推測與酒醅酸度有關。已有報道L.jinshani在酒醅后期占優勢[22]，可能與該菌具有較好的耐酸性有關。發酵后期，隨著白酒釀造的進行,乳酸菌成為后期的絕對優勢微生物，L.jinshani數量得到大量增長，但關于L.jinshani的具體代謝功能與價值還未得到充分研究，其在白酒發酵過程中所起到的作用還有待發掘。目前對L.jinshani的定性定量檢測方法的研究報道較少，因此本研究所建立的能夠快速檢測酒醅中L.jinshani的方法對研究其在白酒釀造過程中的具體功能與價值具有重要意義。

本研究通過設計L.jinshani的特異性引物F:5′-TGCCACAAGGCTATCACCTC-3′；R:5′-AACTCTTGGCTTCGCTGACG-3′建立了q-PCR的方法對L.jinshani進行定量檢測。結果表明該方法靈敏度高，特異性好，能夠方便快捷地定量檢測對樣品中L.jinshani。可有效應用于白酒釀造過程中的L.jinshani的定量與定性檢測，為進一步揭示白酒功能菌株L.jinshani在釀酒過程中的功能提供了有效方法。