以甘藍中花青素為例探究數碼成像比色法的應用

陳妍言 林麗

摘要：選擇甘藍作為實驗材料，以電腦屏幕、96孔微孔板、手機和ImageJ作為數碼成像比色法的主體，進行未知溶液含量的測定、酸堿滴定終點的判斷。在學生已有知識的基礎上，逐步接觸到朗伯-比爾定律、導數法求解酸堿滴定終點。所有的實驗材料均可以在生活中獲得或找到對應的替代品。

關鍵詞：比色;花青素;甘藍;天然酸堿指示劑;微孔板;一階導數;滴定終點

文章編號：1008-0546（2022）04-0084-04

中圖分類號：G632.41

文獻標識碼：B

doi：10.3969/j.issn.1008-0546.2022.04.018

一、問題提出

比色法廣泛運用于物質含量的檢測，即根據溶液顏色的深淺判斷物質含量的多少。可以分為目視比色法和分光光度法。目視比色法通過人眼對溶液顏色的判斷，快速對大量樣品進行分析，但精確度和準確度有限;分光光度法依據物質對特定光的定量吸收，由吸光度得到溶液的濃度，但需要使用昂貴的分光光度計，且學生困惑于儀器盒內儀器工作的原理[1]。解決辦法之一是使用簡單的材料讓學生自主構建分光光度計[1]，學生通過分光光度計觀察到光經過溶液發生的強度變化比他們只能看見等式、圖解或者顯示屏上的數字更加記憶深刻。分光光度計通常由光源、單色器、吸收池和檢測器四個部分構成。生活中常見的材料可以用來構建簡易“分光”光度計：光源用白熾燈、激光筆或LED代替[1];單色器使用光柵、DVD或CD光盤[1];比色皿用試管、試劑瓶等透明玻璃容器[2];檢測器則使用光電二極管或智能手機[3]，其中可以用特定顏色的光，如紅光，來達到光源和單色器“合并”的“分光”目的[2，4]。

近年來國內外有大量文獻報道使用數碼成像的方法進行比色，即在朗伯-比爾定律、RGB色彩空間模型的基礎上，通過照相機、手機，將拍攝的照片輸入到圖像處理軟件中進行數值分析。在測定物質含量上，數碼成像比色法與分光度法相比，需要選取有代表性的物質，例如藍色的硫酸銅溶液[4]、紫紅色的高錳酸鉀溶液[5]，即具有一定的局限性。不過，就測定物質含量和理解朗伯-比爾定律的教育目的上來看，數碼成像比色法簡單易理解、價格低廉且可以利用生活中常見的器材，在中學課堂或課外探究實驗中都能實現。

在圖像處理軟件上，ImageJ優勢明顯，是生命科學領域常用的分析軟件[6，7]。其中插件“readplate”可以在一分鐘內讀取96孔微孔板的圖像信息[6]。已有文獻報道微孔板可以與平板掃描儀配合使用，或直接用LED取代平板掃描儀作為光源[6]。

紫色果蔬如藍莓、桑葚、紫甘藍、紫薯等花青素含量豐富，營養價值高。花青素具有極強的抗氧化活性，可以有效清除自由基，廣泛應用于延緩衰老、保護大腦和改善視力。且花青素在酸性條件下呈現紅色，堿性條件下呈現黃綠色，可以代替酸堿指示劑判定滴定終點。

中學化學實驗要求簡單、有趣味和啟發性。基于此，本文使用LED作為光源，96孔微孔板作為吸收池，手機采集圖像并用ImageJ軟件進行甘藍中花青素含量的測定;在酸堿滴定曲線的基礎上，借助高中數學一階導數的簡單知識進行滴定終點的判定[8]。

二、裝置的構建

1.理解原理

利用學生已有的知識，如綠色植物呈現綠色是因為反射綠光，吸收綠光的互補光，展示自然界中的白光是一種光與其互補光復合而成;亦可使用office辦公軟件的調色盤展示白色由紅、綠、藍三原色組成[9]。

因此當白光通過一有色溶液時，溶液吸收的顏色與其本身互為互補色。物質與光的相互作用體現在物質對光的選擇性吸收上。當強度為I0的光通過溶液時，溶液選擇性吸收一部分光，透射另一部分光。吸收光強度和透射光強度之和為入射光強度。

I0=Ia+It吸光度被定義為入射光強度與透射光強度的比值的以10為底的對數。

而吸收光強度與溶液濃度、吸收池厚度呈現正比例關系，因此吸光度可以用來定量分析溶液濃度，即朗伯-比爾定律。

因此，當一束光透過紅色溶液時，物質將選擇性吸收互補光。通過軟件分析透射光強度變化，即可獲得吸光度變化。

在酸堿滴定曲線中，臨近終點會發生pH的突變，即終點附近的斜率會陡然增大，在δpH/δV圖像上能觀察到最值[9];如果加入指示劑，可觀察到指示劑顏色的改變，利用軟件所得圖像的強度也會發生類似于的突變。故可以收集滴定過程中的溶液，采集圖像信息，繪制圖像強度的一階導數圖，從而判定滴定終點。

2.設計裝置

由于96孔板是平面裝置，可以直接將其放置在電腦屏幕上，在正上方70厘米處進行拍照，如圖1所示。

三、實驗

1.實驗用品

新鮮甘藍、DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）、粉碎機、篩網、Sartorius分析天平、無水乙醇（AR，成都市科隆化學品有限公司）、蒸餾水、無水檸檬酸（AR，成都市科龍化工試劑廠）、錐形瓶、量筒、棕色試劑瓶、96孔微孔板、玻璃比色皿若干、玻璃試劑瓶若干、100-1000μLDragonlab移液槍、燒杯、玻璃棒、7230G可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、電腦、手機。

2.實驗過程（1）樣品的制備

新鮮的甘藍洗凈，切成小塊后放入烘箱于60°C烘干至恒重[10]。用粉碎機粉碎、過篩，裝入樣品袋于干燥處保存。

（2）花青素提取液的制備

稱取1.0000g甘藍粉末，加入50mL2%檸檬酸-60%無水乙醇于60°C提取兩小時。到達預定時間后，過濾，收集濾液至棕色瓶中保存[10]。

（3）花青素濃度梯度液體的制備

用移液槍移取0-5mL的花青素提取液，分別加入到試劑瓶中，補加蒸餾水至10mL（表1）。

（4）溶液吸光度的測量打開可見分光光度計，預熱20min后于波長525nm處測定吸光度[10]。（5）手機比色法測定樣品吸光度使用PowerPoint制作白色的背景圖，將花青素濃度梯度液體和未知濃度液體一同加入到96孔微孔板中，依照設計好的裝置圖擺放樣品，用手機對樣品進行拍照。將圖片輸入到ImageJ中，打開插件“read?plate”，框選左上角第一個孔至右下角第96個孔，如圖2所示，設置采集孔的直徑大小（不宜過大）和分析的通道[6]，輸出數據至Excel中。

（6）氫氧化鈉和鹽酸的滴定

取20mL濃度大約為1mol/L的鹽酸溶液于錐形瓶中，加入蒸餾水至200mL，加入指示劑，用已知濃度的氫氧化鈉進行滴定，在特定的滴定體積處取200μL的溶液至96孔微孔板中，平行測定三組[8]，按照測定吸光度的方法采集圖像信息。

四、結果分析

1.甘藍吸光度分析

如圖3所示，分別使用96孔微孔板和紫外-可見酚酞作為指示劑時，圖像強度對體積的導數度測量時，兩者均可以表現出很好的線性關系，滿足分析的需求，但分光光度計的斜率明顯大于微孔板所測，即靈敏度更高。其中，由96孔微孔板計算所得的未知溶液濃度為2.60mL/10mL，即真實加樣濃度，當使用綠色和藍色通道分析時，均可以得到相似的結果（圖中未展示），紅色通道則不能;紫外-可見光分光光度計所得為2.68mL/10mL，略微偏大。

當使用比色皿、玻璃瓶取代微孔板進行分析時，均可以取得很好的線性關系（R2>0.98），且分析結果也接近于真實加樣濃度，即在無法獲取微孔板時，便可以使用透光性好的玻璃材料代替。此外，還比較了多種獲取RGB值的方法，如網頁版的色彩拾取器、截圖時的對話框信息，ImageJ點像素分析，結果表明，使用ImageJ中的插件“ROI”更能獲取穩定的分析結果，且用于分析的區域位置信息可以以壓縮文件的形式進行保存，方便查看和校對。以上均說明數碼成像比色的適用性強，ImageJ分析方便快速。

2.酸堿滴定終點的判斷

圖4是酚酞作為指示劑進行酸堿滴定時繪制的一階導數圖像，圖中的最值所對應的體積為21.625mL，因為NaOH濃度已知（用鄰苯二甲酸氫鉀標定），故可以求得鹽酸的濃度為1.031mol/L。

圖5是甘藍作為指示劑進行酸堿滴定時繪制的一階導數圖像，圖中的最值所對應的體積為21.125mL，與酚酞作為指示劑相比偏小。由于酚酞的變色范圍為8.2-10.0，因此，甘藍作為指示劑能更好地指示滴定終點。

五、反思與展望

本文以甘藍中的花青素為例，使用96孔微孔板的數碼成像比色法對其含量和作為指示劑時滴定終點的判斷進行了探究。含量測定結果表明，利用ImageJ圖像分析結果與紫外-可見光分光光度計所得結果類似;酸堿滴定實驗中，甘藍的滴定終點更接近中性溶液。

96孔微孔板價格便宜，使用電腦屏幕作為光源代替平板掃描儀進行實驗，同樣可以獲得很好的結果;實驗中所使用的移液槍可以用1mL的醫用微量注射器代替，后者便宜且容易獲取，以上均說明以96孔微孔板的數碼成像比色法推廣到中學實驗中的經濟可行性。

運用生活中的材料甘藍，提取花青素的操作簡單，運用ImageJ分析圖像并將數據導入到Excel中，操作熟悉時可在5min內完成，即滿足中學實驗課的時長限制。

利用學生對綠色植物顏色的已有認知以及高中數學涉及到的一階導數知識，搭建“腳手架”，使學生逐步接觸到物質對光的選擇性吸收、朗伯-比爾定律，以及加深對滴定曲線的認識和滴定終點的判斷。即本實驗所涉及到的知識體現了學科交融的思想，同時也在學生的“最近發展區”內。

實驗中體現的節約思想，如從低濃度到高濃度配制濃度梯度溶液，避免多次更換實驗耗材;微量移取液體的操作;使用熟悉的手機進行化學實驗......以上均可以引導學生對實驗過程進行思考，增加實驗過程的趣味性。

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