南極籃狀真菌抑菌活性發(fā)酵產(chǎn)物分離與鑒定

王玥 陸園園 邢瑩瑩*

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211100）

微生物能產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物，次級(jí)代謝產(chǎn)物大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物。這些活性多樣，結(jié)構(gòu)新穎的化合物可作為藥物的先導(dǎo)化合物。人們已經(jīng)從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)萬(wàn)余種次級(jí)代謝產(chǎn)物，可用于臨床的微生物藥物已經(jīng)達(dá)到百余種[1]。其中真菌更是世界上與人類保持長(zhǎng)久而密切的關(guān)系的第二大生物種群。南極地區(qū)環(huán)境與其余微生物生存的地方很不同，因此南北極地區(qū)被認(rèn)為是潛在、重要的微生物資源庫(kù)，也是產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)和先導(dǎo)化合物菌株的潛在種源地。相對(duì)于溫帶與熱帶地區(qū)的中溫性微生物資源,極地海洋微生物的生物多樣性及藥用價(jià)值仍舊缺少系統(tǒng)深入的調(diào)查研究。有極端氣候的南極地區(qū)發(fā)現(xiàn)的微生物分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)比氣候溫和的微生物分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)說(shuō)有不同的結(jié)構(gòu)與功能活性，或許能成為藥物重要的先導(dǎo)化合物，是人們還未研究透徹的課題[2]。分離培養(yǎng)方法的改進(jìn)、功能基因研究、代謝調(diào)控、新的篩選模型等新的研究方法手段的引入，也將為極地微生物的藥用研究提供更廣闊的研究空間[3]。為了進(jìn)一步以南極真菌的特殊代謝為基礎(chǔ)，為抗菌藥物的篩選提供更多的先導(dǎo)化合物，本文對(duì)分離自南極海洋淤泥的5.8S rDNA 序列為藍(lán)狀菌屬的真菌SP-9 的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化共得到六個(gè)化合物，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

真菌SP-9 由中國(guó)藥科大學(xué)海洋藥學(xué)教研室保存。體外抗菌檢測(cè)用的菌株由實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PDA）:SIGMA-ALDRICH 公司；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）:SIGMA-ALDRICH 公司；Luria-Bertani 培養(yǎng)基（LB）:SIGMA-ALDRICH 公司。淺層芝麻固體培養(yǎng)基：50 m L 玻璃錐形瓶中加入50 g 大米和50 mL水，121℃滅菌20 min。淺層大米固體培養(yǎng)基：50 mL 玻璃錐形瓶中加入50 g 大米和50 mL 水，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵

1.2.1.1 菌株活化

將甘油保存的菌株SP-9 接種到PSA 培養(yǎng)基上，放入28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 天。

1.2.1.2 種子液的制備

挑取菌株SP-9 PSA 培養(yǎng)基上活化的單菌落接種到裝有50 mLPDA 培養(yǎng)基的150 mL 錐形瓶中。培養(yǎng)條件：28℃，180 r/min，時(shí)間3 天，得到SP-9 種子液，種子液為均一培養(yǎng)液。

1.2.1.3 固體靜置發(fā)酵

每50 g 芝麻/大米固體培養(yǎng)基中接入5 mL SP-9 種子液，搖勻后于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)30 天后萃取發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分離純化與活性測(cè)定。

1.2.2 分離純化

菌株SP-9 芝麻固體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)乙醇萃取，減壓濃縮后獲得的粗品經(jīng)大孔樹(shù)脂色譜柱，洗脫后的水：乙醇(40%-80%）組分合并為Fr.2 后進(jìn)硅膠柱，按氯仿：甲醇梯度洗脫后得到組分90:1（Fr.2-1）、80:1（Fr.2-2）、70:1（Fr.2-3）、60:1（Fr.2-4）、50:1-10:1（Fr.2-5）。組分Fr.2-2（氯仿:甲醇80:1），經(jīng)ODS 色譜柱以及Sephadex LH-20 凝膠凝膠色譜柱得到化合物1（5 mg）、化合物2（10 mg）和化合物3（12 mg）。組分Fr.2-3（氯仿:甲醇70:1），經(jīng)ODS 色譜柱以及高效液相制備（溶劑甲醇:水1:1，v/v，tR=27 min）得到化合物5（6 mg）。組分Fr.2-4（氯仿: 甲醇60:1）經(jīng)ODS 色譜柱以及Sephadex LH-20 凝膠柱色譜（甲醇）得到化合物6（5 mg）。

菌株SP-9 大米固體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)乙醇萃取，減壓濃縮后獲得的粗品進(jìn)硅膠色譜柱按氯仿: 甲醇洗脫得到組分90:1（A）、80:1（B）、70:1（C）、60:1（D）、50:1-10:1（E）。組分B（氯仿:甲醇80:1）進(jìn)硅膠H 色譜柱得到化合物3（42 mg）。組分D（氯仿:甲醇60:1）進(jìn)硅膠H 色譜柱得到化合物4（31 mg）。

1.2.3 活性測(cè)試

抑菌實(shí)驗(yàn)采用96 孔板聯(lián)合酶儀檢測(cè)最低抑菌濃度（MIC）值。將幽門(mén)螺旋桿菌（Helicobacter pylori）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎雙球菌（Streptococcus pneumonia）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、 藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）分別制成一定濃度的菌懸液（1×105CFU/mL）。

將化合物樣品稀釋為一系列濃度梯度后，分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(100 mL 菌液+100 mL 樣品)、陽(yáng)性藥組(100 mL 菌液+100 mL 陽(yáng)性藥)、調(diào)零組（200 mL LB 培養(yǎng)基）、空白對(duì)照組（100 mL 菌液+100 mL LB 培養(yǎng)基），每孔設(shè)置三個(gè)重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)24 個(gè)小時(shí)后檢測(cè)OD600，公式[1-（實(shí)驗(yàn)組-調(diào)零組）/空白對(duì)照組]計(jì)算抑制率大于80%的最低樣品濃度可視為最低抑菌濃度（MIC）。對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用Students' t-test 比較法。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:1H-NMR (123 MHz, DMSO-d6) δ: 6.84(2H, dd, J1=18.1, J2=26.0 Hz), 6.75 (1H, s), 6.44 (1H, s),5.97 (1H, s), 5.85 (1H, d, J=11.8 Hz), 4.86 (1H, d, J=4.9 Hz), 4.60 (1H, d, J=5.1 Hz), 4.33 (2H, d, J=4.9 Hz),4.08-4.15 (2H, m), 3.20 (3H, d, J=4.6 Hz), 2.52 (1H, s).13C-NMR (125 MHz, DMSO- d6) δ: 149.2, 147.8, 146.9,146.7, 140.2, 136.0, 120.6, 119.9, 108.5, 107.0, 106.0,101.3, 101.0, 98.0, 85.0, 81.3, 72.2, 71.3。

以上數(shù)據(jù)與 Trowitzsch-Kienast W 等報(bào)道的(+)-Episesamin 數(shù)據(jù)[4]基本一致，確定化合物1 為(+)-Episesamin。

化合物2:1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 7.58(1H, dd, J1=10.0, J2=2.5 Hz), 7.50 (1H, s), 7.0 (1H, d, J=8.2 Hz), 6.93 (1H, d, J=10.0 Hz), 6.85 (2H, dd, J1=8.0,J2=19.0 Hz), 5.95 (2H, s), 4.68 (1H, d, J=11.3 Hz), 4.11(2H, m), 4.00 (1H, dd, J1=5.3, J2=7.37 Hz), 3.47 (2H, m),3.40 (2H, s), 2.52 (2H, s).13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 198.0, 152.1, 148.4, 147.7, 147.0, 136.1,131.4, 125.4,120.3, 108.6, 108.3, 108.2, 107.2, 102.6, 101.3, 83.3, 70.6,60.2, 53.6, 49.6, 40.5, 40.3, 40.2, 40.1, 40.0, 39.8, 39.7,39.5。

以上數(shù)據(jù)Chiung YM 等報(bào)道的Sesaminone 數(shù)據(jù)[5]基本一致，確定化合物2 為Sesaminone。

化合物3:1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7.51 (1H,td, J1=8.0, J2=8.0, J3=1.4 Hz),7.25 (2H, dd, J1=1.0, J2=7.8 Hz), 7.16 (3H, td, J1=8.0, J2=8.1, J3=1.0 Hz), 7.14 (2H, dd,J1=1.2, J2=8.0 Hz), 4.04 (1H, s), 3.26 (3H, s).13C-NMR(125 MHz, CD3OD) δ: 167.7, 166.0, 132.6, 131.7, 130.2,129.2, 129.0, 128.2, 127.1, 126.1, 125.5, 120.8,77.3, 77.0,76.8, 70.3, 64.9, 31.5。

以上數(shù)據(jù)與劉軍亮等報(bào)道的Cyclopenin 數(shù)據(jù)基本一致[10]，確定化合物3 為Cyclopenin。

化合物4:1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 8.44 (1H,s), 7.55 (1H, td, J1=7.0, J2=7.0, J3=2.0 Hz), 7.25 (2H, dd,J1=7.8, J2=1.0 Hz), 7.17 (1H, dd, J1=1.7, J2=7.8 Hz), 7.14(1H, td, J1=8.0, J2=7.0, J3=1.0 Hz), 7.04 (1H, t, J=7.8 Hz),6.76 (1H, dt, J1=2.0, J2=7.0, J3=8.0 Hz), 6.26 (1H, t, J=1.8 Hz), 4.56 (1H, s), 4.13 (1H, s).13C-NMR (125 MHz,CD3OD) δ: 166.0, 165.5, 157.1, 135.1, 132.6, 131.1, 129.0,127.3, 124.7, 117.1, 115.7, 112.5, 70.3, 64.6, 30.3。

以上數(shù)據(jù)與劉軍亮等報(bào)道的Cyclopenol 數(shù)據(jù)基本一致[10]，確定化合物4 為Cyclopenol。

化合物5:1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 1.02 (3H, s),1.14 (3H, s), 2.50 (2H, m), 4.09 (1H, dd, J1=10.5, J2=6.5 Hz), 5.00 (1H, s), 5.10 (2H, m), 5.66 (1H, s), 6.03 (1H, m),6.57-7.20 (6H, m), 7.66 (1H, s), 11.02 (1H, s), 11.81 (1H,s).13C-NMR (125 MHz, CDCL3) δ: 165.53, 158.47, 150.38,143.59, 137.51, 135.17, 128.93, 128.84, 126.69, 125.26,118.83, 117.13, 114.54, 108.97, 104.94, 78.03, 77.29,77.04, 76.78, 61.62, 59.14, 40.97, 37.23, 23.01, 22.50,0.02。

以上數(shù)據(jù)與Scott PM等報(bào)道的Isoroquefortine C 數(shù)據(jù)基本一致[11]，確定化合物為Iso-roquefortine C。

化合物6:1H-NMR (500 MHz, CDCL3) δ: 10.22 (1H,s), 5.10 (1H, s), 7.73 (1H, s), 6.40 (1H, s), 6.07(1H, m),5.70 (1H, s), 5.28 (1H, s), 5.04 (1H, dd, J1=10.0, J2=8.0 Hz), 4.12 (1H, dd, J1=8.0, J2=2.0 Hz), 2.58 (2H, m), 1.17(3H, s), 1.06 (3H, s).13C-NMR (125 MHz, CDCL3) δ:167.2, 159.5, 150.0, 143.3, 136.8, 135.1, 129.1, 128.6,125.5, 125.2, 121.9, 119.2, 114.8, 111.3, 109.2, 78.4, 77.3,77.1, 76.9, 61.5, 58.8, 40.9, 36.8, 22.9, 22.5。

以上數(shù)據(jù)與Scott PM 等報(bào)道的roquefortine C 數(shù)據(jù)基本一致[12]，確定化合物為roquefortine C。

2.2 化合物的抑菌活性

與同濃度的陽(yáng)性對(duì)照藥物卡那霉素相比，化合物1 對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）的生長(zhǎng)有明顯抑菌作用，化合物2、5、6 對(duì)藤黃微球菌（Micrococcus luteus）有明顯的抑菌作用，化合物1、3 對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）有明顯抑菌作用（表1）。

表1 化合物1-6 的抗鮑曼不動(dòng)桿菌、抗大腸桿菌、抗金黃色葡萄球菌、抗肺炎雙球菌、抗綠膿桿菌、抗藤黃微球菌活性

3 討論

在本次研究中，我們從來(lái)自南極海洋淤泥的籃狀真菌SP-9 的芝麻固體光照發(fā)酵產(chǎn)物中提取得到四種化合物。化合物1，2 分別為芝麻相關(guān)物質(zhì)d- 表芝麻素[4]和芝麻酮[5]，具有抗氧化[6]，抗炎[7]，抗腫瘤[8]等活性。因?yàn)閐- 表芝麻素本不存在于芝麻中[9]，無(wú)法直接從芝麻中提取得到，猜測(cè)這種芝麻衍生物的生成和產(chǎn)量可能與南極淤泥真菌SP-9 的存在有關(guān)，而芝麻酮經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)量可能得到提升[5]，這些猜想還待進(jìn)一步研究。化合物3，4 分別為圓弧菌素和圓弧菌醇[10]，此前研究發(fā)現(xiàn)可以抗炎[11]。化合物5，6 分別為異煙棒曲霉素C 和異煙棒曲霉素C 的3，12 雙鍵異構(gòu)體[12-13]，此類化合物具有抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌活性[14]。此次研究此次研究發(fā)現(xiàn)化合物1 對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）的生長(zhǎng)有明顯抑菌作用，發(fā)現(xiàn)化合物5、6 對(duì)藤黃微球菌（Micrococcus luteus）有明顯的抑菌作用，化合物1 和3 對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）有明顯抑菌作用。這些活性化合物均是第一次在南極淤泥中分離的籃狀真菌SP-9 中發(fā)現(xiàn)，具有多種生物活性，為藥物的篩選和設(shè)計(jì)提供了良好的參考。

但是，受到分離純化得到的這些化合物量有限，在本研究中未能對(duì)其體內(nèi)活性以及其余多種活性作用機(jī)制的研究，對(duì)真菌產(chǎn)生這些化合物的發(fā)酵過(guò)程也沒(méi)有深入研究。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將會(huì)分離更多的化合物并對(duì)活性進(jìn)行深入研究。