沙柳沙障沙埋段5種木腐真菌的生物學特性

段曉婷, 高 永, 梁鈺鎂, 王瑞東, 趙 晨, 郭 鑫

(內蒙古農業大學 沙漠治理學院, 內蒙古 呼和浩特 010020)

沙柳(Salixpsammophila)沙障是中國西北地區防沙治沙的主要工程措施之一[1-2]，能夠在一定程度上改善土壤養分狀況[3-4]，有利于增加沙丘表層細顆粒的含量明顯降低地表粗化[5]，通過改變近地表風沙流結構[1]，有效控制土地沙化，且固沙成本較低[6]，所以被廣泛用于荒漠化地區。然而，障體的使用效益具有一定周期，這主要是環境因子與微生物的綜合作用[7]，沙柳沙障沙埋段腐化障體的主要腐解微生物為木腐真菌[8]，木腐真菌以菌絲體或孢子形式在沙柳沙障障體表面以及內部生長[9]，使障體細胞壁受到破壞，導致障體理化性質和物質組成發生變化，障體變得松軟易碎，呈現出篩孔狀或粉末狀等形態[10]，最終導致沙柳沙障因破損發生倒伏。

木腐真菌是造成障體沙埋部腐爛的主要微生物[11]，其生長在各種形態的木材基質上[12]，木腐真菌通過分泌過氧化物酶和漆酶降解障體中的木質素和纖維素[13-14]使障體內部出現一系列細胞塌陷、空腔等腐化現象，且木腐真菌菌絲對木材C，N等營養元素具有重要的吸收和轉移作用，促使障體物質組成發生變化[15]，從而失去其本身的價值。目前，關于沙柳沙障腐化規律、破損規律、作用機制、沙柳沙障對土壤的改良作用及其固沙效益等方面已得到一定的研究[1-6]，微生物作為沙柳沙障腐朽的主要原因，前人研究了不同垂直位置微生物數量的分布特征，及其與障體腐蝕之間的聯系，以及致腐因子和防腐性能等方面[7-9]，相對于沙柳沙障腐朽過程中不同木腐真菌的生物學特性研究尚顯不足。

基于此，本研究以分離自內蒙古自治區鄂爾多斯市獨貴塔拉鎮境內庫布齊沙漠穩定沙埋段障體木腐真菌為研究對象，探究不同培養條件(碳源、氮源和酸堿度)對障體沙埋段木腐真菌生長的影響，以篩選其適宜的生長條件，初步了解障體沙埋段木腐真菌的生物學特性，以期為延長沙柳沙障使用周期提供理論依據。

1 研究區概況

研究區位于內蒙古自治區鄂爾多斯市獨貴塔拉鎮境內庫布齊沙漠，地處鄂爾多斯高原脊線的北部(39°22′33″—40°52′14″N，106°55′16″—109°16′02″E)。研究區屬于溫帶大陸性季風氣候，年均降水量227 mm，年均蒸發量2 400 mm，地貌類型主要為流動沙丘、半流動沙丘和固定沙丘。土壤質地主要為壤土，以粉砂質壤土和砂質壤土為主，植被類型主要包括沙柳(Salixpsammophila)、甘草(Glycyrrhizauralensis)、花棒(Hedysarumscoparium)、檸條(Caraganakorshinskii)、楊柴(Hedysarummongolicum)和豬毛菜(Salsolacollina)等[16]。

2 研究方法

(1) 菌種制備。障體取自2019年11月3日，選取沿S24穿沙公路兩側已鋪設5 a的沙柳沙障1 m×1 m規格樣地，樣品采集方法參照“樹木病原真菌”的分離方式[17]來進行特定部位取樣，使用經高溫滅菌的枝剪剪取穩定沙埋段障體受真菌侵染的部位，無菌密封袋封裝標記，低溫保存運回實驗室，于超凈工作臺上進行兩種操作，一部分直接挑取障體表面菌絲進行分離培養，剩余部分用鑷子夾取障體破損較嚴重部位碎木屑進行分離培養，在25 ℃恒溫箱中培養。待平板上長出不同形態和不同顏色的菌落后，分別反復挑取直至獲得純菌株。接種于斜面培養基，存放于4 ℃備用。本試驗使用的5種木腐真菌均為前期分離純化保存于沙地植物抗逆生理實驗室的菌種。將菌種接種于90 mm的PDA平板培養基上，25 ℃培養3～5 d，然后用已滅菌的打孔器(直徑5 mm)在菌落邊緣打取菌餅，用于固體和液體培養接種。

(2) 培養基。

①PDA培養基：馬鈴薯(去皮)100 g，葡萄糖 10 g，瓊脂 10 g，蒸餾水 500 ml，蛋白胨 2.5 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB10.005 g，氯霉素0.05 g。

②碳源基礎培養基：以PDA培養基為基礎，將葡萄糖用等量甘露醇、羧甲基纖維素鈉、淀粉和麥芽糖代替。

③氮源基礎培養基：以PDA培養基為基礎，蛋白胨用等量尿素、氯化銨、硫酸銨和草酸銨代替。

④pH值基礎培養基：以PDA培養基為基礎，使用NaOH和HCl溶液調節培養基酸堿度。

(3) 不同碳源、氮源和酸堿度試驗。①固體培養：用等量甘露醇、羧甲基纖維素鈉、淀粉和麥芽糖代替不同碳源培養基中的葡萄糖；用等量尿素、氯化銨、硫酸銨和草酸銨代替不同氮源培養基中的蛋白胨；使用NaOH與HCl溶液調節培養基的pH值。將5種真菌分別接種于不同碳源、氮源和酸堿度培養基的中心位置，25 ℃恒溫培養7 d，以接種塊為中心每24 h測量菌落直徑(mm)，設3個重復，每個重復隨機測量3次，取平均值。計算菌絲日均長速[18]：

②液體培養：去除PDA培養基中的瓊脂進行液體培養。于250 ml的錐形瓶中裝入等量100 ml液體PDA培養基，每瓶接種1個菌餅，25 ℃，120 r/min搖床培養7 d，過濾收集菌絲并用蒸餾水沖洗3次，放于錫紙上，80 ℃烘干至恒質量后稱量菌絲干質量(生物量)，每種處理3個重復[19-20]。

(4) 數據處理。采用Excel 2010對試驗數據進行整理，使用SPSS 20.0(one-way ANOVA)分析對不同碳源、氮源和酸堿度下木腐真菌的平均生長速率以及生物量進行方差分析，并利用Duncan法進行差異顯著性檢驗；使用Origin 2021軟件繪圖。

3 結果與分析

3.1 不同碳源對5種障體木腐真菌生長的影響

由圖1可知，5種碳源下木腐真菌均可以生長。固體培養條件下，葡萄糖為桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和黑曲霉的最佳碳源，它們的生長速度分別為12.97 mm/d，8.56 mm/d，13.25 mm/d和5.22 mm/d。桔綠木霉、Xs木霉和哈茨木霉以葡萄糖為碳源較羧甲基纖維鈉顯著提高了52.6%，2.3倍和36.3%(p<0.05)；黑曲霉則在5種碳源下的排序為：葡萄糖>甘露醇>麥芽糖>羧甲基纖維素鈉>淀粉。

注：不同大寫字母表示同一碳源下不同木腐真菌間差異顯著(p<0.05)；不同小寫字母表示不同碳源下木腐真菌間差異顯著(p<0.05)。下同。

液體培養條件下，同樣桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉、擬康氏木霉和黑曲霉以葡萄糖為碳源時生物量最大，其生物量分別為446.67，454.67，728.67，687.67，713.00 mg/100 ml。綜上所述葡萄糖是5種碳源中最適合木腐真菌生長的碳源。

3.2 不同氮源對5種障體木腐真菌生長的影響

由圖2可知，固體培養條件下，Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉最佳氮源均為蛋白胨，桔綠木霉最佳氮源為硫酸銨。其平均生長速度表現為：哈茨木霉>Xs木霉>擬康氏木霉；桔綠木霉則在以硫酸銨為氮源的培養基中平均生長速度最快13.06 mm/d。桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉以蛋白胨為氮源較以草酸銨為氮源平均生長速度顯著提高61.0%，3.7倍、2.7倍和7.8倍(p<0.05)。液體培養條件下，桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉以蛋白胨為氮源時生物量最大，氯化銨為氮源時黑曲霉生物量較大。以蛋白胨的為氮源時生物量分別為473.33，453.00，558.33，526.33 mg/100 ml，黑曲霉生物量為610.00 mg/100 ml，且較其他氮源差異顯著(p<0.05)。

圖2 不同氮源對5種木腐真菌生長的影響

3.3 不同pH值對5種障體木腐真菌生長的影響

由圖3可知，不同pH值使真菌的生長以及生物量產生差異。固體培養條件下，初始pH=5為Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉最適酸堿度，初始pH=6的培養基中黑曲霉生長速度較快，桔綠木霉在初始pH=5和pH=6的培養基中生長速度無顯著差異(p<0.05)。其中Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉分別較pH=9平均生長速度顯著提高4.1倍、78.0%和56.9%；桔綠木霉在初始pH=5和pH=6的培養基中生長速度為5.22，6.33 mm/d，黑曲霉在初始pH=6的培養基中平均生長速度為6.33 mm/d。綜上所述，5種木腐真菌適合在弱酸性條件下生長。

圖3 不同酸堿度對5種木腐真菌生長的影響

液體培養條件下，初始pH=7時桔綠木霉生物量較大，Xs木霉和擬康氏木霉最適酸堿度為初始pH=5，哈茨木霉和黑曲霉在初始pH=6時生物量較大。其中，桔綠木霉在初始pH=7時生物量為673.00 mg/100 ml，Xs木霉和擬康氏木霉較初始pH=9顯著提高42.6%和22.7%(p<0.05)，哈茨木霉在初始pH=6時的生物量為591.00 mg/100 ml，黑曲霉則是較初始pH=9顯著提高14.3%(p<0.05)。

4 討論與結論

4.1 討 論

充足的碳源、氮源和適宜的pH值是微生物生長繁殖所需的必要條件。碳源為微生物的生長代謝主要提供所需碳元素[21]，提供細胞生命活動所需的能量，其次氮源是作為構成生物體的蛋白質、核酸及其他氮素化合物的材料。pH值改變則會引起細胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對營養物質的吸收，同時會影響酶的活性。明確障體木腐真菌生物學特性可對障體的腐朽機制及腐朽成因等方面的研究提供理論依據，從而延長障體使用壽命。

由于不同樣本的木腐真菌群落對碳源利用的模式也存在一定差異[22]，本文研究的5種木腐真菌除擬康氏木霉以外，剩余4種木腐真菌最適碳源均為葡萄糖，這與Zeng等[23]對Phellinusbaumii的研究結果一致，可能是因為葡萄糖為單糖，真菌可以直接吸收與利用，但在Le等[24]對P.nebrodensis的研究得出最適碳源為麥芽糖，這與本文結果不一致，可能是二者所選的真菌類型不同，Le所選的真菌為百靈菇屬于擔子菌綱，主要引起白色腐朽，而本研究中哈茨木霉和黑曲霉屬絲孢綱，因此其利用碳源的方式不同，將培養基內營養物質分解為自身需要簡單碳水化合物的方式存在差異。

5種木腐真菌在不同的氮源培養基質下均能夠生長，但對不同氮源的利用程度存在一定差異。除桔綠木霉最適氮源為硫酸銨和黑曲霉無最適氮源外，剩余3種木腐真菌最適氮源均是蛋白胨。該研究結果與顧瓊楠等[25]對牛筋草炭疽菌的研究相悖。其研究發現，牛筋草炭疽菌最適氮源為酵母粉。可能是不同真菌群落所分泌酶的種類不同，代謝培養基內的營養物質的酶活性有所差異，其次代謝方式存在一定差異。本文中哈茨木霉、Xs木霉和擬康氏木霉在以蛋白胨為氮源的培養基中生長速度均達13.17，9.44，8.78 mm/d，這與Ha等[26]對P.japonica研究結果一致，原因是有機氮是一種植物、土壤和肥料相結合的含氮物質，所以有機氮較無機氮更有利于真菌的產生和積累一些代謝產物[27]，營養更加豐富，成分復雜。有機氮源除含有豐富的蛋白質、肽類、游離的氨基酸以外，還含有少量的糖類、脂肪和生長因子有利于木腐真菌的生長繁殖。同時，尿素作為氮源時，除黑曲霉平均生長速度較快以外，剩余4種木腐真菌平均生長速度均較緩慢，原因可能是尿素會使培養基pH值增大，影響菌株對培養基中營養物質的吸收速度[28]。

pH值是影響真菌生理和生長的主要因素之一，真菌通常僅限于在接近中性的狹窄 pH值范圍內生長，許美玲等[29]研究發現外生菌根真菌在弱酸性條件下生長最好。在本文研究的5種木腐真菌中，固體培養條件下，桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉最適pH值為6，桔綠木霉和黑曲霉最適pH值為5。液體培養條件下，5種真菌大部分最適酸堿度集中在pH=6，同樣是在弱酸性的條件下生長最好，與周慧杰[30]對外生菌根真菌的研究結果一致。同時，在龔萍[31]對沙柳沙障的研究中得出偏酸性的土壤能夠促進沙柳沙障的腐蝕，證明了木腐真菌更適合在弱酸性條件下生長，原因是木腐真菌在堿性條件下會影響真菌細胞膜和離子的解離度，從而干擾木腐真菌對培養基中營養物質的吸收[32]，導致木腐真菌不能正常進行產物的積累以及代謝。

障體的分解主要是由于真菌的孢子和細胞的生長繁殖而引起的。木腐真菌需要在足夠的條件下才可以生長，主要有營養、溫度、水分和酸堿度等。孫芳利等[33]研究得出化學防腐可以封閉菌類，使菌類缺乏營養，以達到抑制其生長和繁殖的目的。本文通過對5種木腐真菌的研究得出其最適條件，因此可根據木腐真菌最適營養條件選擇合適的化學藥劑。如秦理哲等[34]研究發現ACQ防腐處理會引起馬尾松木材酸堿性質、化學元素組成和官能團強度的變化，從而改變木腐真菌最適生長環境。范慧青[35]通過炭化處理降低木材酸堿度和減少木材碳源氮源的供給使真菌的生命活動受到限制。本文5種木腐真菌適合弱酸性條件，因此對于因腐朽進行定期更換的沙柳沙障來說，同樣可以通過不同濃度的ACQ改變木腐真菌最適條件或對障體進行一定的處理改變障體為微生物提供的生存環境，以延長沙柳沙障使用壽命。

4.2 結 論

桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和黑曲霉的最適碳源為葡萄糖，羧甲基纖維素鈉不適合作為5種木腐真菌的碳源；Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉3種木腐真菌最佳氮源為蛋白胨，草酸銨不適合作為Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉的氮源；5種木腐真菌均適合在弱酸性條件下生長，pH=9時5種木腐真菌平均生長速度變緩，特別是哈茨木霉不適合在pH=9的條件下生長。