子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中PDHA1的表達(dá)及臨床意義

吳雅珣，張邢松，沈 蓉，朱興華，賈美群

腫瘤細(xì)胞在氧充足的條件下依靠糖酵解，而不是氧化磷酸化作為能量來源的現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解。現(xiàn)已證實(shí)，有氧糖酵解可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pyruvate dehydrogenase complex, PDC)和丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase, PDK)是糖代謝途徑中的關(guān)鍵線粒體酶，兩者相互作用可以調(diào)節(jié)有氧呼吸與Warburg效應(yīng)之間的比例。PDC通過催化丙酮酸氧化脫羧為乙酰輔酶A的限速步驟在氧化磷酸化和糖酵解中發(fā)揮連接作用[1-2]。PDC主要包含三種酶組成成分：丙酮酸脫氫酶E1亞基、二氫脂酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(E2亞基)以及脂酰胺脫氫酶(E3亞基)。PDK通過磷酸化丙酮酸脫氫酶E1亞單位α(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, PDHE1α)(又稱PDHA1)調(diào)節(jié)PDC的活性[3]。文獻(xiàn)報(bào)道PDHA1表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，包括膠質(zhì)瘤[4]、膽管癌[5]、乳腺癌[6]、食管癌[7]、前列腺癌[8]、肝癌[9]。本組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，PDHA1低表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)[10]。然而，PDHA1在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)中的表達(dá)及意義仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測(cè)PDHA1在130例CSCC組織中的表達(dá)，分析PDHA1在CSCC中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2007年12月～2014年8月江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院確診的130例CSCC。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，收集患者的臨床病理資料，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 免疫組化免疫組化染色采用EnVision法，操作步驟嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。一抗PDHA1(sc-377092，稀釋度1 ∶200)購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。二抗及DAB購(gòu)自DAKO公司。用已知陽性組織作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判讀免疫組化評(píng)分采用組織化學(xué)評(píng)分(histochemistry score, H-score)。按著色強(qiáng)度：無陽性著色為0分，弱著色為1分，中等著色為2分，強(qiáng)著色為3分。H-score=3×強(qiáng)著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)+2×中等著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)+1×弱著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。H-score范圍為0～300。將H-score<150定義為PDHA1低表達(dá)，H-score≥150定義為PDHA1高表達(dá)。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)分析在線下載TCGA CSCC基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，合計(jì)納入252例CSCC，利用該數(shù)據(jù)集分析PDHA1 mRNA表達(dá)對(duì)患者總生存期(overall survival, OS)的影響。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征患者年齡29～75歲，中位年齡53歲，其中<45歲30例，≥45歲100例。無脈管癌栓111例，有脈管癌栓19例。腫瘤分化程度：高+中分化61例，低分化69例。浸潤(rùn)深度<1/3層62例，≥1/3層68例。腫瘤直徑<4 cm 121例，≥4 cm 9例。無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移110例，有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。FIGO分期：Ⅰ+ⅡA期110例，ⅡB+Ⅲ期20例。

2.2 PDHA1表達(dá)及其與CSCC臨床病理特征的相關(guān)性PDHA1蛋白陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，130例CSCC中，PDHA1高表達(dá)70例，低表達(dá)60例(圖1、2)。CSCC組織和對(duì)應(yīng)癌旁鱗狀上皮組織中PDHA1免疫組化H-score分別為150.5±5.004、67.38±4.629，其在CSCC組織中的表達(dá)高于對(duì)應(yīng)癌旁鱗狀上皮組織(P<0.000 1)。PDHA1表達(dá)與患者年齡(P=0.004)、腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.002)、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)以及FIGO分期(P<0.001)相關(guān)，其在年齡<45歲、浸潤(rùn)深度<1/3層、無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分期Ⅰ+ⅡA期組中表達(dá)較高；PDHA1表達(dá)與是否有脈管癌栓、腫瘤分化程度以及腫瘤直徑無關(guān)(P均>0.05，表1)。

圖1 A.CSCC組織中PDHA1高表達(dá)，EnVision法；B.對(duì)應(yīng)癌旁鱗狀上皮組織中PDHA1低表達(dá)，EnVision法 圖2 A.CSCC組織中PDHA1低表達(dá)，EnVision法；B.對(duì)應(yīng)癌旁鱗狀上皮組織中PDHA1低表達(dá)，EnVision法

表1 PDHA1蛋白表達(dá)與CSCC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PDHA1表達(dá)與CSCC患者預(yù)后的關(guān)系在TCGA數(shù)據(jù)集中，PDHA1 mRNA高表達(dá)CSCC患者較低表達(dá)患者的OS長(zhǎng)(P=0.000 4，圖3)。對(duì)本組130例CSCC患者進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)：PDHA1蛋白高表達(dá)組較低表達(dá)組患者的OS長(zhǎng)(P=0.029 3，圖4)。單因素Cox回歸分析顯示：盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.005)、FIGO分期(P=0.005)以及PDHA1表達(dá)(P=0.043)是CSCC患者預(yù)后的影響因素。多因素Cox回歸分析顯示：FIGO分期(P=0.037)是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。PDHA1表達(dá)水平是影響OS的相關(guān)因素，但不是預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P=0.151，表2)。

表2 CSCC患者預(yù)后的單因素及多因素Cox回歸分析

圖3 TCGA數(shù)據(jù)集中PDHA1 mRNA表達(dá)與CSCC患者OS的關(guān)系

圖4 CSCC中PDHA1蛋白表達(dá)與患者OS的關(guān)系

3 討論

正常細(xì)胞的糖代謝包括無氧糖酵解和有氧氧化磷酸化。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞即使在氧充足的條件下也以糖酵解代謝為主，這種現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)。PDC是一種門控多蛋白復(fù)合物，可催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，從而調(diào)節(jié)線粒體活性。PDHA1是PDC的主要組成成分，可被丙酮酸脫氫酶磷酸酶PDP1和PDP2去磷酸化，也可被PDK磷酸化。PDHA1去磷酸化可激活PDC，而PDHA1磷酸化則可抑制PDC活性[11]。PDHA1表達(dá)及活性下降，則Warburg效應(yīng)增強(qiáng)，加速腫瘤細(xì)胞分裂，腫瘤侵襲性增加[12]。

Liu等[13]報(bào)道，在食管鱗狀細(xì)胞癌中，抑制PDHA1基因表達(dá)可增強(qiáng)Warburg效應(yīng)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和耐藥。Zhong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PDHA1與食管鱗狀細(xì)胞癌分化程度有關(guān)，其在高分化腫瘤中表達(dá)較高。Sun等[9]報(bào)道，與癌旁肝組織相比，PDHA1在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，PDHA1表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分化、TNM分期相關(guān)，而與患者年齡、性別以及是否有肝硬化無關(guān)；在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)PDHA1可降低PDH的活性并影響腫瘤細(xì)胞的代謝狀態(tài)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PDHA1 mRNA在腸型、彌漫型以及混合型胃癌中的表達(dá)水平顯著降低；免疫組化結(jié)果顯示PDHA1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁胃黏膜組織，且PDHA1在低分化胃癌中的表達(dá)低于高+中分化胃癌；PDHA1表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及神經(jīng)侵犯相關(guān)，而與患者性別、年齡、Lauren分型以及脈管侵犯無關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PDHA1蛋白在CSCC組織中的表達(dá)(H-socre：150.5±5.004)顯著高于癌旁鱗狀上皮組織(H-socre：67.38±4.629)(P<0.000 1)。PDHA1表達(dá)與患者年齡(P=0.004)、腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.002)、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)以及FIGO分期(P<0.001)相關(guān)，其在年齡<45歲、浸潤(rùn)深度<1/3層、無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分期Ⅰ+ⅡA期患者中的表達(dá)較高；PDHA1表達(dá)與是否有脈管癌栓、腫瘤分化程度以及腫瘤直徑無關(guān)(P均>0.05)。Zhong等[7]報(bào)道PDHA1低表達(dá)食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良。在卵巢癌中，PDHA1低表達(dá)與高FIGO分期以及較短的OS以及無進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)相關(guān)[14]。Sun等[9]報(bào)道，PDHA1低表達(dá)肝癌患者的OS顯著縮短。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PDHA1低表達(dá)胃癌患者的OS顯著縮短，PDHA1表達(dá)是胃癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，TCGA數(shù)據(jù)集中PDHA1 mRNA高表達(dá)CSCC患者較低表達(dá)患者的OS長(zhǎng)(P=0.000 4)；本組對(duì)130例CSCC患者進(jìn)行Cox生存分析發(fā)現(xiàn)：PDHA1蛋白高表達(dá)組患者較低表達(dá)組患者的OS長(zhǎng)(P=0.029 3)；多因素生存分析顯示：PDHA1表達(dá)水平是影響OS的相關(guān)因素，但不是預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P=0.151)。值得注意的是，“PDHA1高表達(dá)CSCC患者預(yù)后較好”似乎與“PDHA1在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織”相悖。有研究報(bào)道，敲低PDHA1表達(dá)可通過抑制脂肪生成抑制前列腺癌的形成[11]。因此，筆者推測(cè)早期階段PDHA1可能通過某種或某些特定的機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生，隨后PDHA1可能通過影響Warburg效應(yīng)調(diào)控腫瘤的發(fā)展，而這一推論是否成立仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，PDHA1在CSCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁鱗狀上皮組織，PDHA1在年齡<45歲、浸潤(rùn)深度<1/3層、無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分期Ⅰ+ⅡA期CSCC患者中的表達(dá)較高，PDHA1高表達(dá)CSCC患者較低表達(dá)患者的OS長(zhǎng)。PDHA1表達(dá)水平是影響OS的相關(guān)因素，但不是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。