紫外分光光度法測定阿司匹林有效期的教學實驗設計

倪亞楠， 李宇杰， 馮 蕊， 沈 彤， 張勝紅

（北京石油化工學院化學工程學院，化學化工國家級實驗教學示范中心，北京 102617）

0 引 言

隨著我國在2016年正式加入國際工程聯盟的“華盛頓協議”，國內工科高校的本科教學更加重視創新能力和工程實踐能力的培養，而實驗教學是培養學生創新意識和實踐能力的重要環節［1］。基于工程教育專業認證的理念和標準，大學實驗課程不僅要加深學生對工程基礎和專業知識的理解，更重要的是要培養學生基于科學原理和方法解決實際工程問題的研究能力，如設計實驗、分析和解釋數據、并通過信息綜合得到合理有效的結論。

具體到制藥工程專業的物理化學實驗課程，傳統的驗證性動力學實驗，如蔗糖水解和乙酸乙酯皂化反應動力學參數的測定，在工程教育專業認證背景下已難以有效支撐相應的畢業要求指標點。為此，設計了具有制藥專業特色的動力學綜合化學實驗——阿司匹林水解反應動力學參數及其有效期的測定。阿司匹林，又名乙酰水楊酸，是一種常見的非甾體藥物，廣泛用于解熱、陣痛、抗炎和抗血栓等方面［2］。阿司匹林的合成、制劑、溶出、鑒別和質量分析是藥物化學及相關專業的經典實驗內容［3-7］。作為阿司匹林實驗教學中的重要一環，其水解反應不僅有助于學生深度理解酯水解反應機理和動力學，而且是阿司匹林有效期預測和藥物劑型設計的理論基礎。

1 實驗設計思路

乙酰水楊酸水解反應通常用作阿司匹林定量分析的一個手段［8］，尚未發展為一個獨立的化學反應動力學教學實驗。究其原因，阿司匹林水解反應動力學參數的測定主要基于絡合顯色法［9-11］：即采用可溶性Fe3+鹽與其水解產物形成穩定的紫色絡合物，然后監測該絡合物在～525 nm波長處的吸光度來間接測定阿司匹林的含量。絡合顯色法需要pH值為2.5～3.5的弱酸性環境穩定水楊酸鐵絡合物，因此難以模擬阿司匹林溶液的近中性存儲環境；此外，該方法操作過程繁瑣且耗時較長，無法滿足4～8 h的物理化學實驗學時要求。張彩云等［12］采用雙波長紫外分光光度法消除水楊酸對阿司匹林的干擾，在加速實驗條件下測定了阿司匹林水解反應的動力學參數。遺憾的是，該方法忽略了產物水楊酸（pKa=2.98）對溶液pH值以及阿司匹林水解速率的影響，理論上存在瑕疵。

借鑒上述研究成果，本實驗采用近中性的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH=6.85，25℃）模擬阿司匹林溶液的存儲環境，采用紫外分光光度法監測產物水楊酸的吸光度以及阿司匹林水解反應的進度。通過測定50～80℃范圍內阿司匹林水解反應的速率常數k計算該反應的平均表觀活化能Ea并推測室溫下（25℃）阿司匹林溶液水解反應的速率常數和有效期。

2 實驗實施

2.1 實驗教學方法

本實驗采用問題導向的探究性教學。首先啟發學生思考：為什么常見的阿司匹林藥品是片劑而不是針劑或者口服液？然后引出化學穩定性是影響藥物劑型的重要因素，進而介紹藥品有效期的概念并引導學生思考如何通過加速實驗法測定阿司匹林水解反應的動力學參數和藥物有效期。

2.2 實驗安排

本實驗項目定位為綜合性或開放性物理化學實驗，也可進一步融入藥學相關的專業綜合實驗。實驗時長為8學時，教學組織方面可以采用2人1組或4人1組，要求學生共同設計實驗方案并分工協作。第1階段（4學時），任課教師講解實驗原理、儀器操作和實驗注意事項，重點引導學生檢討并修訂實驗內容和方案。學生配制相關溶液，確定紫外可見光譜儀的工作波長并測定70和80℃時阿司匹林水解反應的動力學參數。第2階段（4學時）：學生測定50和60℃時阿司匹林水解反應的速率常數。

2.3 實驗原理

阿司匹林在水溶液中不穩定，易于水解生成水楊酸和醋酸。

其中，酸和堿（尤其是H+和OH-離子）都能夠催化該水解反應，盡管堿催化阿司匹林水解反應的速率遠高于酸催化或自水解反應速率［13］。因此，實際測得的速率是同步發生的各水解反應速率的總和［14］，即

式中：k0，kH和kOH分別為阿司匹林自水解、H+和OH-離子催化阿司匹林水解反應的速率常數；而kHA和kB分別為其他廣義酸（HA）和堿（B）催化該反應的速率常數。

盡管阿司匹林水解反應可能存在不同的路徑，但在pH值恒定的實際反應中該過程通常只由一種機理主導，并且該反應在水介質中可以按準一級反應處理［14］。因此，阿司匹林水解反應速率與其濃度呈正比，即

式中：c為時間t時阿司匹林的濃度；k為速率常數。

將式（2）積分得：

式中，c0為阿司匹林的初始濃度。

根據Lambert-Beer定律，在選取的工作波長（如水楊酸的最大吸收波長）處，反應未開始、達到平衡和任意t時刻的溶液吸光度（記作A0，A∞和At）可以分別采用下式表示：

式中：b為石英比色皿的內部寬度；ε和ε′分別為阿司匹林和水楊酸在選定波長下的摩爾吸光系數。

此外，鑒于阿司匹林水解反應的平衡常數遠大于106，可以合理假設反應達到平衡時阿司匹林完全水解并采用濃度為c0的水楊酸溶液的吸光度數值替代A∞［14］。

將式（4）～（6）聯立，得：

進一步將式（7）和（8）代入式（3）得：

以ln（A∞-At）對t作圖，由擬合直線的斜率即可求得反應在不同溫度時的速率常數k。假設該反應的表觀活化能Ea在50～80℃區間內為定值，依據

中的Arrhenius方程以lnk對1/T作圖并由擬合直線的斜率即可得到水解反應的Ea值。

進一步假設該反應的Ea在20～80℃范圍內為常數，將式（10）外推至298 K即可計算25℃時阿司匹林水解反應的k值。藥品的有效期通常是指藥物有效組分損失10%所需的時間（τ0.9）。相應地，阿司匹林水溶液的τ0.9值可以根據25℃時水解反應的k值由下式進行計算：

2.4 主要試劑及儀器

試劑：乙酰水楊酸（阿司匹林），水楊酸，醋酸，NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4，均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器：G-10雙光束紫外可見分光光度計（讓奇儀器科技有限公司）；SYC-15c超級恒溫水浴（南京桑力電子設備廠）；電子分析天平，容量瓶，100 mL磨口錐形瓶。

2.5 實驗步驟和注意事項

（1）溶液配制。首先配制NaH2PO4和Na2HPO4濃度均為25 mmol/L的緩沖溶液1 L并以此為溶劑配制濃度為0.1 mmol/L的阿司匹林溶液，以及等濃度的水楊酸和醋酸溶液。

（2）確定工作波長。待紫外可見分光光度計穩定后，以緩沖溶液為參比測定阿司匹林、水楊酸和醋酸溶液在210～600 nm波長范圍內的紫外可見吸收光譜，選擇阿司匹林和醋酸干擾較小的水楊酸最大吸收波長為工作波長。

（3）測定阿司匹林水解反應速率常數。將盛有適量新鮮配制的阿司匹林溶液的帶塞錐形瓶分別置于50、60、70和80℃的恒溫水浴槽中并開始計時。每隔10 min吸取少許反應液滴入石英比色皿中并置于大量室溫水浴中冷卻2 min，然后以緩沖溶液為參比測定該反應液的吸光度。其中，50、60、70和80℃恒溫水浴反應的時長分別控制為180、180、120和90 min。

注意事項：阿司匹林溶液要現用現配，配制過程可以采用超聲輔助溶解；水浴加熱過程中錐形瓶磨和磨口之間可以夾持細濾紙條，在保證實驗安全的情況下盡可能地減少溶劑的揮發。

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3 結果與討論

3.1 工作波長的確定

乙酰水楊酸、水楊酸和醋酸的pKa分別為3.57、2.98和4.75，在近中性的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中3者主要以離子的形式存在且對光的吸收集中在紫外區，如圖1所示。其中，水楊酸及其共軛離子的最大吸收波長為296 nm，阿司匹林和醋酸的共軛酸堿對在此波長理論上均不存在吸收［14］。由于常溫下阿司匹林水溶液的輕微水解，實際測得的A0和A∞分別為0.007 8和0.401 4。因此，實驗中可以忽略阿司匹林和醋酸的影響，采用296 nm波長處的吸光度A監測水楊酸的濃度以及阿司匹林水解反應的進度。

圖1 阿司匹林及其水解產物的紫外-可見吸收光譜

3.2 阿司匹林水解反應的速率常數

圖2所示給出了不同溫度和反應時長時阿司匹林水解反應液在296 nm處的吸光度。隨著反應時間的延長，吸光度的數值逐步增大，表明阿司匹林逐漸轉化為水楊酸；此外，隨反應溫度從50℃提高到80℃，吸光度的遞增明顯加劇，表明升高溫度能夠加快阿司匹林水解反應進程。

圖2 溫度和時間對阿司匹林溶液吸光度的影響

為降低原始數據點散亂性引起的誤差，利用Origin軟件中的ExpGro1型指數遞增函數擬合吸光度數據并采用擬合的At值以ln（A∞-At）對t作圖，結果如圖3所示。ln（A∞-At）與t高度線性相關，證實阿司匹林水解遵從一級反應動力學。由擬合直線斜率得到阿司匹林水解反應在50、60、70和80℃的速率常數分別為1.67×10-3、4.06×10-3、8.02×10-3和1.70×10-2min-1。

圖3 不同溫度下阿司匹林水解溶液的ln（A∞-A t）～t曲線

3.3 阿司匹林水解反應的表觀活化能

基于不同溫度下阿司匹林水解反應的k值，以lnk對1/T作圖并進行線性擬合，結果如圖4所示。擬合直線的線性回歸決定系數R2為0.998，較好地吻合Arrhenius方程。由擬合直線斜率得到的Ea為72.6 kJ/mol，符合68.6～73.6 kJ/mol的文獻值［15］，同時也接近傳統絡合顯色法測得的弱酸性介質中阿司匹林水解反應的活化能（69.8～73.0 kJ/mol）［9-11］，表明此實驗方法具有較高的準確性。

圖4 溫度對阿司匹林水解反應速率常數的影響

將圖4中的擬合直線進一步外推可得25℃時阿司匹林水解反應的k為1.75×10-4/min，這一數值與Baker［16］的研究結果（1.54×10-4/min，22.5℃）吻合。相應地，阿司匹林在NaH2PO4和Na2HPO4緩沖溶液中的有效期τ0.9為602 min，即10 h。如此短的藥物有效期表明阿司匹林不宜采用溶液型注射劑的形式保存。

3.4 阿司匹林水解反應機理

阿司匹林水解反應的機理與溶液的pH值密切相關。文獻［13-14］中詳細研究了不同pH值下的阿司匹林水解反應，發現在pH值為4.5～8.5時其水解反應速率幾乎不變且反應機理以Br?nsted堿（B堿）輔助的水分子親核加成為主，即：

水分子不是一個活潑的親核試劑，在中性環境中難以進攻酯羰基碳并引發酰氧鍵的斷裂（反應決速步）。但阿司匹林的羧基在pH值大于4.5的環境中主要以羧酸根離子（B堿）的形式存在，能夠誘導水分子的去質子化并賦予其更強的親核能力［14］。因此，中性環境中阿司匹林水解反應的機理主要為分子內B堿輔助的水分子親核加成。

4 結 語

阿司匹林有效期的測定是一個以化學反應動力學為主，同時涵蓋紫外分光光度法、酯水解反應機理和藥物劑型設計等相關知識點的短學時綜合化學實驗。該實驗以學生感興趣的真實問題為導向，能夠有效激發學生的學習主動性并訓練其綜合運用所學理論知識分析和解決實際問題的能力。此外，該實驗反應條件溫和、試劑使用量少、不產生酸堿廢液且不涉及大型高端儀器的使用，有望替代傳統的蔗糖水解和乙酸乙酯皂化反應動力學實驗在普通高等院校物理化學實驗教學中推廣。