建立和驗證藥物安全性評價中實驗病理學定量檢測指標參考值范圍的影響因素和方法

王曉秋，江佳佳

（1.蘇州西山中科藥物研究開發有限公司，江蘇蘇州 215104；2.江蘇大學澳洋腫瘤研究院，江蘇蘇州 215600）

臨床病理學檢測是藥物安全性評價中非常靈敏的重要研究手段，用于實驗動物健康檢查和篩選、疾病診斷和監測，評估藥物對實驗動物造成的毒性反應類型和程度以及毒性反應是否具有劑量關系、是否可逆等。藥物安全性評價中解讀給藥組動物臨床病理學數據改變時，除應比較同期對照組動物數據和給藥組動物給藥前的基礎數據之外，還應結合實驗動物臨床病理學檢測指標的參考值范圍進行綜合分析，這樣才能做出正確判斷[1]。臨床病理學檢測國際協調聯合科學委員會推薦了藥物安全性評價中血液學、臨床化學和尿液分析等臨床病理學檢測指標[2]，由于實驗動物定量檢測指標值與正常人相比差異較大，如北平頂猴外周血白細胞參考值范圍為（6.0～31.4）×109L-1[3]，人外周血白細胞參考值范圍則為（3.5～9.5）×109L-1[4]。因此，科學合理地建立和驗證實驗動物臨床病理學檢測指標的參考值范圍具有極其重要的意義，但目前國內外在此方面尚未頒布明確的技術指南。雖然國內外已有一些文獻報道了不同動物臨床部分病理學定量檢測指標的參考值范圍[5-11]，但建立方法差異較大，科學性和規范性尚存疑問，且參考值范圍的驗證也基本未有提及。因此，本文在參考國內外臨床診斷和獸醫學等技術領域的相關技術指導原則及文獻[12-16]的基礎之上，結合藥物安全性評價工作的特殊性，探索性地提出藥物安全性評價中實驗動物臨床病理學定量檢測指標參考值范圍的建立和驗證應考慮的影響因素和方法，為藥物安全性評價研究提供參考和借鑒。

1 參考值范圍的建立

臨床病理學定量檢測指標包括血液學、臨床生物化學、凝血和免疫學等指標。建立這些定量檢測指標參考值范圍可以通過前瞻性研究或回顧性研究2種方式，對于藥物安全性評價研究機構而言，回顧性研究顯然更為可行。無論采取哪種方式，在獲得足夠的健康動物臨床病理學定量檢測指標數據時，均應盡快完成這些指標參考值范圍的首次建立。

1.1 動物參考群體分組

實驗動物的年齡、性別、營養狀態、生殖狀況、飼養狀況、地理位置和活動等因素均有可能會影響動物參考群體各項臨床病理學定量檢測指標的數值[17-18]，故在理想情況下，應為不同類別動物建立單獨的參考值范圍。如不可行，參考群體應根據上述因素進行劃分，以獲得能代表健康動物群體的臨床病理學定量檢測指標數據的生物學分布。實際工作中，至少應按動物性別和年齡分組來分別建立參考值范圍[10-11]。

1.2 動物參考個體篩選標準

應建立詳細的動物參考個體篩選標準，如動物體重、活動性、飲食、排泄、傳染病檢查和腸道寄生蟲檢查等，以確保排除不健康的動物[19-20]。

對于大動物而言，可選擇未進入研究專題的經適應期和檢疫期的健康貯備動物，或研究專題中對照組中的健康動物和（或）給藥組中給藥前的健康動物。對于小動物而言，可選擇未進入研究專題的經適應期和檢疫期的健康貯備動物，或選擇研究專題中對照組中的健康動物。

1.3 動物參考個體數量

參考值是通過對參考個體某一特定量進行觀察或測量而得到的檢測結果。參考值范圍通常包括參考上限和參考下限，兩參考限之間（含2個參考限）的區間則為參考值范圍，通常是中間95%的數據分布范圍[1，12]。代表每一動物參考群體的動物參考個體至少需120只，以保證能正確建立90%置信水平的臨床病理學定量檢測指標數據的參考值范圍，如按99%置信水平來建立，則至少需要198 只動物參考個體[12-13]。例如，王茵等[21]采用260只8～10周齡的SD大鼠，雌雄各130只，建立了多項血液生化指標的參考值范圍，其中血清白蛋白和血糖的參考值范圍雌雄動物之間差異無統計學意義（P＞0.05），故實際應用時可合并計算，此時這2項指標所建立的參考值范圍來源于260只SD大鼠，可達到99%置信水平；而膽固醇、血清總蛋白、丙氨酸轉氨酶和尿素氮的參考值范圍雌雄動物之間差異有統計學意義（P＜0.01），因此在實際應用時宜按雌雄性別分別統計，此時每組動物參考個體數量為130只，則每組所建立的參考值范圍可達到90%置信水平。

通常根據置信水平的要求來考慮所需動物參考個體數量即可，若納入更多數量的動物參考個體并不會顯著提高參考值范圍的置信水平，且有可能增加樣品采集和檢測等各方面的成本。

1.4 樣品采集的要求

用于建立參考值范圍的動物樣品的采集條件應盡可能一致，如動物禁食情況、動物保定條件、樣品采集程序和樣品處理程序等[17-18]，以消除樣品采集環節對樣品檢測結果可能造成的影響。每一動物參考個體每一定量檢測指標只需采集一份樣品以獲得單一代表性的檢測數據，相同樣品類型需求的定量檢測指標可以共用一份樣品。

1.5 樣品檢測的要求

用于樣品檢測的檢測系統，廣義上來說，包括檢測人員、檢測儀器、檢測試劑和標準操作規程等要素，應為準確度和精密度等技術指標已驗證合格的檢測系統或檢測方法，并定期參加官方機構或第三方權威機構組織的室間質評活動且成績合格，且已為檢測系統制定了科學合理的常規校準程序和室內質控程序，并嚴格按照試劑生產商的要求接收、儲存和使用各類檢測試劑。

樣品應在采集后立即檢測[14-16]，如因故不能立即檢測，可以按穩定性已驗證的儲存條件和儲存周期進行暫存后再進行檢測[14]。檢測時應嚴格按照已制定的相關標準操作規程進行，檢測數據應在所伴隨的室內質控數據符合接受標準的前提下，再經過審核無誤后才能發放。

1.6 樣品檢測數據的處理

將每一定量檢測指標的所有樣品檢測數據進行排序，并將最高值減去最低值以獲得數據全距（range，R），將次高值加上R/3，次低值減去R/3獲得一個新的范圍，如疑似離群值超過此范圍，則應將其作為真實離群值進行剔除[12]。若剔除離群值后樣品檢測數據不足120個，則需補足[12]。若為前瞻性研究，則需新增動物參考群體數量繼續檢測直至獲得足夠符合要求的數據量。若為回顧性研究，則可直接調用同一動物參考群體中符合要求的數據以補足。

采用SAS和SPSS等專業統計分析軟件評估每一定量檢測指標剔除離群值后的所有樣品檢測數據是否符合正態分布（高斯分布）。對于符合正態分布的檢測數據，使用參數統計方法按x±2SD來估算參考值范圍；對于不符合正態分布的檢測數據，使用非參數統計方法按百分位數法來估算P2.5～P97.5的參考值范圍。

2 參考值范圍的驗證

2.1 參考值范圍的驗證條件

當一個藥物安全性評價研究機構的臨床病理學定量檢測指標的參考值范圍首次建立后，在動物參考群體的來源、樣品采集條件以及檢測系統未發生改變時，通常不需要定期驗證參考值范圍的適用性或定期更新參考值范圍。

但如發生下列情況時，則在參考值范圍首次建立后需進行驗證：①動物參考群體的來源、樣品采集條件以及檢測系統發生改變時，如動物供應商改變、更換樣本采集裝置、檢測儀器更新、檢測試劑更換等；②首次建立參考值范圍時因故未能獲得足夠數量的檢測數據；③考慮直接引用來自其他藥物安全性評價研究機構公布的參考值范圍。

2.2 參考值范圍驗證的實施

采集可以代表每一動物參考群體的20只動物參考個體的樣品進行檢測。按1.6處理方式，檢查每一定量檢測指標全部20個樣品檢測數據中是否存在離群值，如有則需剔除并用其它動物參考個體的樣品檢測數據進行補足。

如果20個檢測數據中只有不超過2個數據不在原參考值范圍之內，則說明該參考值范圍仍適用。

如果超過2個數據不在原參考值范圍之內，則應再取另外20只動物參考個體的樣品進行檢測，同樣進行離群值檢查、剔除和檢測數據補足，如果新獲得的20個檢測數據中只有不超過2個數據不在原參考值范圍之內，則說明該參考值范圍適用，否則需要重新建立參考值范圍。

3 參考值范圍的應用和解析

在評估檢疫期動物的健康狀態、藥物安全性評價研究中對照組動物的健康狀態、給藥組動物給藥前的健康狀態時，可以直接依據臨床病理學參考值范圍來評估臨床病理學檢測數據是否異常以及異常的程度，并結合動物一般檢查、籠邊觀察、體重、攝食量和體溫等情況對動物的健康狀態進行綜合判斷。

在評估給藥組動物給藥后的臨床病理學指標是否出現毒性改變以及毒性改變的程度時，由于同一藥物安全性評價研究中給藥組動物和對照組動物來源、年齡、營養狀態、飼養和處置方式相同，故應先比較給藥組動物與同期對照組動物的臨床病理學檢測數據均值之間的差異是否具有統計學意義[1-2]。給藥組動物與對照組動物的臨床病理學檢測數據均值之間的差異無統計學意義時，可以初步判斷給藥組動物給藥后臨床病理學指標未出現毒性改變。給藥組動物與對照組動物的臨床病理學檢測數據均值之間的差異有統計學意義時，則繼續檢查給藥組動物給藥后臨床病理學檢測數據是否已超出參考值范圍。

若給藥組動物給藥后的臨床病理學檢測數據未超過參考值范圍，則可初步判斷給藥組動物給藥后臨床病理學指標未出現毒性改變，與同期對照組動物檢測數據之間的差異雖具有統計學意義，但并不具有生物學意義和毒理學意義。若給藥組動物給藥后的臨床病理學檢測數據超過參考值范圍，則分析是否僅屬于藥效指標發生改變，例如，促紅細胞生成素引起的紅細胞數量上升、特立帕肽（teriparatide）引起的血鈣升高等表明藥效指標發生了改變。那么這些藥效指標的改變僅具有統計學意義和生物學意義，但并不具有毒理學意義。

若給藥組動物給藥后的臨床病理學檢測數據超過參考值范圍，且不屬于藥效指標，則可初步判斷這些指標的改變具有毒理學意義，并進一步結合給藥組動物給藥前檢測數據和同期其他劑量組給藥動物檢測數據來綜合評估臨床病理學指標毒性改變的程度以及是否具有劑量依賴性。

另外，由于藥物安全性評價研究中各組動物數量較少，尤其是大動物（如食蟹猴和Beagle犬），因此無論給藥組和對照組之間的差異是否具有統計學意義，均應觀察各組動物個體數據是否超過參考值范圍。如超過，則需結合該動物的臨床觀察指標和組織病理學檢查結果等進行綜合判斷，從而完整地評價藥物毒性作用。

4 結語

目前，已有研究報道了不同周齡幼年SD大鼠以及不同品系不同周齡小鼠的生化指標參考值范圍[10-11，22]。此外，北平頂猴、食蟹猴和 Beagle犬等實驗動物的血液學和血液生化指標的參考值范圍也有報道[3，9，23-24]，但凝血指標參考值范圍的報道較少，僅見SD大鼠的凝血酶原時間的研究報道[25]。臨床病理學定量檢測指標參考值范圍在藥物安全性評價研究中對于正確解讀臨床病理學定量檢測指標數據、正確評價實驗動物的健康狀態、實驗動物疾病診斷和治療以及正確評估藥物對實驗動物毒性等具有非常重要的意義。如何科學、規范地建立和驗證臨床病理學定量檢測指標的參考值范圍是一項亟待解決的問題，希望在不遠的將來能夠出臺相關技術指導原則，從而為新藥研發助力。