三七葉苷對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用研究*

楊 帆，劉春娜

(錦州醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，遼寧錦州 121001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DNP)是引起慢性腎衰竭的主要病因之一，也是造成接近30%糖尿病患者最終死亡的原因。據最新統計，在中國已有1.298億的糖尿病患者，如何防治糖尿病并發癥，特別是DNP的發生、發展已成為首要任務[1]。DNP是由于高糖代謝紊亂引起的慢性腎損害，其病理改變表現為腎小球細胞的肥大，腎基底膜增厚及系膜擴張，細胞外基質積聚，腎小球硬化及間質纖維化。其中，腎間質纖維化(kidney interstitial fibrosis，KIF)是引起腎臟疾病進入慢性腎衰竭的最終途徑。研究發現，基質細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)可通過刺激單核、巨噬細胞向泡沫細胞轉化，進而使多種炎性因子表達上調，并促使纖維連接蛋白和膠原的表達上調，同時也造成腎臟固有細胞肥大，最終誘導腎小球硬化和KIF的發生。近年的研究發現，多種炎性細胞因子、炎性酶等促進腎臟組織增殖肥厚、纖維化，參與DNP的進展[2]。新近的研究發現，傳統中藥三七葉的提取物——三七葉苷(PPD-25-OH)，可能對DNP有預防和治療作用。PPD-25-OH具有多重藥理作用，如抗氧化應激、抗炎鎮痛、降血脂和對糖尿病視網膜病變的保護作用，但其對DNP的作用和相關機制方面的研究較少。PPD-25-OH是否通過降低上述炎性趨化因子表達，在DNP中發揮保護作用仍不清楚[3-4]。因此，本研究采用DNP大鼠模型，給予受試藥物PPD-25-OH，旨在深入探討其對DNP的保護作用及可能的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

健康SD大鼠，體重200～220 g，由錦州醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXK：2014-0010。

1.1.2實驗藥品

PPD-25-OH提取物通過高效液相法自行提取，提取純度>98%的單體化合物，分子結構為：20(S)-25-OCH3-PPD。測定SDF-1、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)試劑盒均購自美國BOSTER生物制劑有限公司；單核細胞趨化因子(monocyte chemotactic factor，MCP-1)試劑盒及結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組及給藥

取SD大鼠，鏈脲佐菌素(45 mg/kg)腹腔注射，3 d后測定血糖>16.7 mmol/L定義為糖尿病模型，每日給予高糖、高脂飲食，共12周，誘導DNP模型的建立。取上述造模成功的40只DNP大鼠，每組10只，分為DNP組(生理鹽水)、PPD-25-OH低劑量組(PPD-L組，10 mg/kg PPD-25-OH)、PPD-25-OH中劑量組(PPD-M組，30 mg/kg PPD-25-OH)及PPD-25-OH高劑量組(PPD-H組，50 mg/kg PPD-25-OH)，另取10只SD大鼠作為空白陰性對照組(NG組，生理鹽水)，灌胃給藥4周。

1.2.2血生化指標及腎功能的測定

在給藥4周后，各組實驗動物采用20%烏拉坦(1 g/kg)麻醉，行頸動脈插管術并取血2 mL，3 000 r/min離心10 min，離心后取上清液，測定血肌酐和尿素氮水平，并用代謝籠收集24 h尿液測定尿蛋白，一方面證明DNP造模成功，另一方面測定PPD-25-OH對糖尿病腎功能改變。

1.2.3測定腎臟指數和病理改變

取血后，各組實驗動物均剖取右腎，用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后稱重，計算腎臟指數=腎質量(mg)/體重(g)，用腎臟指數作為反映腎臟肥厚的量化指標，并間接反映腎纖維化的程度。以4%多聚甲醛溶液固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，石蠟包埋，制成4 μm切塊備用，進行病理檢測。

1.2.4腎組織炎性因子的測定

上述實驗結束后，處死各組大鼠，迅速剖取左腎，用冰生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛溶液固定，PBS沖洗，—70 ℃凍存備用。取一部分腎組織采用ELISA法測定SDF-1、COX-2，用酶標儀于530 nm處測定吸光度(A)值，測定結果以nmol/mg 蛋白表示。另采用Western blot，檢測腎組織MCP-1及CTGF蛋白表達，作為反映腎臟纖維化的指標。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 PPD-25-OH對DNP大鼠腎功能及腎臟指數的影響

DNP大鼠出現多飲、多食、多尿的糖尿病典型癥狀，逐漸消瘦并體重降低，證明DNP造模成功。DNP組血肌酐、尿素氮、尿蛋白和腎臟指數水平明顯升高，與NG組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與DNP組比較，PPD-L、M、H組血肌酐、尿素氮、尿蛋白和腎臟指數水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 PPD-25-OH對DNP大鼠腎臟病理改變的影響

病理結果中發現DNP大鼠腎組織均出現明顯病理改變，即腎小球變形，腎間質纖維增生，腎小球及腎間質有大量的炎性細胞浸潤，證明DNP造模成功。PPD-25-OH干預后，可以抑制DNP模型大鼠腎小球基底膜增厚、系膜基質增多及腎間質纖維增生，腎小球變形不嚴重，并能減輕腎小球炎性細胞浸潤，且PPD-L、M、H組與DNP組比較，損傷明顯減輕，見圖1。

表1 PPD-25-OH對DNP大鼠腎功能及腎臟指數的影響

A：NG組；B：DNP組；C：PPD-L組；D：PPD-M組；E：PPD-H組。

2.3 PPD-25-OH對DNP大鼠腎組織炎性因子的改變

DNP組SDF-1、COX-2水平升高，與NG組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與DNP組比較，PPD-L、M、H組SDF-1與COX-2水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.4 PPD-25-OH對DNP腎組織MCP-1及CTGF蛋白表達的影響

DNP組MCP-1和CTGF蛋白表達水平均明顯升高，與NG組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與DNP組比較，PPD-L、M、H組MCP-1和CTGF蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與NG組比較；b：P<0.05，與DNP組比較。

A：PPD對DNP大鼠腎組織中MCP-1表達的影響；B：PPD對DNP大鼠腎組織中CTGF表達的影響；1：NG組；2：DNP組；3：PPD-L組；4：PPD-M組；5：PPD-H組；a：P<0.05，與NG組比較；b：P<0.05，與DNP組比較。

3 討 論

DNP的主要病理改變包括腎臟組織的肥厚、腎細胞的肥大。其中，腎組織的纖維化是DNP最主要的病理特征，因此，防治腎纖維化是預防及治療DNP及多種腎臟疾病的主要手段和措施[5-6]。

本實驗中，DNP大鼠均出現多飲、多尿、體重降低，血肌酐、尿素氮及腎臟指數明顯增高，而給予PPD-25-OH治療后，能明顯改善上述癥狀，并能降低血肌酐、尿素氮和腎臟指數，證明其對腎功能有改善作用。腎臟指數是反映腎臟增大、肥厚的重要指標。DNP組腎臟指數增大表明已出現腎臟肥厚，這是由于腎臟膠原纖維增多，促進腎臟增厚纖維化，腎臟硬度也隨之增加，腎臟功能出現異常[7-8]。PPD-25-OH可降低腎臟指數，提示其通過降低腎纖維化，對腎臟肥厚有抑制作用。病理結果也證實，PPD-25-OH干預后，腎組織病理改變減輕，且可抑制大鼠腎小球基底膜增厚，抑制腎間質纖維增生。該結果進一步驗證了DNP大鼠造模成功，也提示PPD-25-OH能通過改善腎功能，減輕腎組織肥厚，對DNP有治療作用。

實驗結果證實PPD-25-OH能降低腎組織中炎性因子SDF-1與COX-2蛋白水平。SDF-1對腎小球系膜細胞具有趨化作用，COX-2是生成炎性介質前列腺素的重要酶，在DNP腎臟組織肥厚和纖維化的病理性重構中，二者均發揮了趨化促進作用[9-10]。MCP-1是單核巨噬細胞的特異性趨化因子，可由體內多種細胞產生，當腎組織受到刺激，特別是炎癥刺激后，MCP-1 mRNA及蛋白質表達水平隨腎纖維化加重而增高，MCP-1通過趨化單核巨噬細胞在腎小管間質聚集，介導腎間質炎癥及腎間質纖維化，從而促進DNP纖維化的發展[11]。另外，CTGF是促進腎臟和多種器官發生纖維化的最主要細胞因子，其水平高低能直接反映纖維化的程度。CTGF的過度表達可激活其下游信號分子和激酶，促進腎臟組織纖維化和肥厚，從而導致腎臟病理性重構[12]，PPD-25-OH降低MCP-1和CTGF的表達，提示其通過抑制炎性纖維化因子，進而抑制DNP的纖維化起到對腎臟的保護作用。

綜上所述，PPD-25-OH可有效抑制DNP腎臟增殖肥厚，進而改善腎功能，改善腎間質纖維化，對DNP大鼠腎臟組織具有保護作用，其保護作用與抑制炎性因子SDF-1與COX-2的水平、降低MCP-1與CTGF蛋白表達有關。