外周血Beclin-1、Atg5表達與老年膿毒癥患者預后的相關性*

王 佳,高恒波,林雪容,羅肖宇,陳麗君,韓樹池

(1.河北北方學院附屬第一醫院急診科，河北張家口 075000;2.河北醫科大學 第二醫院急診科，石家莊 050000)

膿毒癥是臨床常見的危重癥，由重癥感染、大面積燒傷、大手術引起，可發展為膿毒癥休克、多器官功能障礙。老年患者的基礎疾病多、各項機體功能退化、免疫功能減弱，發生膿毒癥后的預后差，更容易發生多器官功能障礙，救治難度大、死亡率高。在臨床實踐中，早期判斷膿毒癥的病情及預后對指導治療、改善預后具有積極意義。近些年，感染后免疫抑制在膿毒癥發病過程中的作用受到越來越多關注，淋巴細胞耗竭是影響膿毒癥患者預后的重要因素，與淋巴細胞耗竭相關的機制包括細胞凋亡及自噬等[1-3]。

自噬是由溶酶體介導的細胞內小分子物質降解過程，適度的自噬有利于細胞在嚴酷環境下的存活。有動物實驗報道，膿毒癥小鼠體內CD4+T淋巴細胞數目明顯減少，激活自噬能夠促進CD4+T淋巴細胞的存活，表明自噬在膿毒癥的發病過程中對淋巴細胞具有保護作用[4]。另有研究報道，膿毒癥患者外周血淋巴細胞中自噬相關蛋白Beclin-1及自噬相關基因5(autophagy-related gene 5，Atg5)表達水平降低與病情加重、預后惡化有關[5-6]，提示膿毒癥發病過程中淋巴細胞的自噬受到抑制，進而可能削弱自噬對淋巴細胞的保護作用，引起淋巴細胞數目減少并導致膿毒癥病情加重。但目前自噬在老年膿毒癥發病及預后評估中的作用尚不清楚。因此，本研究將以自噬為切入點觀察外周血自噬相關蛋白Beclin-1、Atg5表達與老年膿毒癥患者預后的相關性，旨在闡明自噬在老年膿毒癥發病中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2019年10月河北北方學院附屬第一醫院收治的136例老年膿毒癥患者作為膿毒癥組。納入標準：(1)符合《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[7]中膿毒癥的診斷標準；(2)年齡60歲以上；(3)入院后立刻留取外周靜脈血標本；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)合并惡性腫瘤、血液系統疾病、免疫功能缺陷疾病；(2)入院前正在使用免疫抑制劑或糖皮質激素治療。選取同期體檢且一般資料與膿毒癥組匹配的55例健康者作為對照組。膿毒癥組男75例、女61例，年齡62～76歲，平均(70.38±9.85)歲；對照組男32例、女23例，年齡60～72歲，平均(68.28±11.45)歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究取得醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1外周血Beclin-1、Atg5表達的檢測

取膿毒癥組和對照組的外周靜脈血5 mL，采用淋巴細胞分離液(上海碧云天公司)分離淋巴細胞，而后加入RIPA裂解液(上海碧云天公司)裂解淋巴細胞、提取蛋白，采用BCA試劑盒(上海碧云天公司)檢測蛋白水平，將含有30 μg蛋白的標本用于Western blot實驗。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜1 h，1∶1 000稀釋的Beclin-1、Atg5一抗(英國Abcam公司)或1∶2 500稀釋的β-actin一抗(美國Sigma公司)4 ℃孵育PVDF膜過夜，洗膜3次后室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，最后在凝膠成像儀(美國Bio-rad公司)中顯影得到蛋白條帶，根據條帶灰度值、以β-actin為內參計算Beclin-1、Atg5的表達水平。

1.2.2臨床資料收集

查閱膿毒癥患者的病歷，收集以下臨床資料：性別，年齡，既往病史[高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)]，生命體征(體溫、收縮壓、舒張壓)，入院24 h的實驗室檢查指標[白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、單核細胞計數、血小板計數、血紅蛋白、清蛋白、血肌酐、C反應蛋白、降鈣素原，計算中性粒細胞/淋巴細胞比值(neutrophil lymphocyte ratio，NLR)、血小板/淋巴細胞比值(platelet lymphocyte ratio，PLR)、單核細胞/淋巴細胞比值(monocyte lymphocyte ratio，MLR)]，根據入院后24 h內各項指標的最差值計算急性生理和慢性健康評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)。

1.2.3預后情況判斷

查閱膿毒癥患者的病歷，根據入院后28 d的病情判斷預后(包括存活和死亡)，自動出院或臨終前放棄的患者均視作死亡。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組外周血Beclin-1、Atg5表達水平比較

與對照組比較，膿毒癥組外周血Beclin-1、Atg5的表達水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測外周血Beclin-1、Atg5的表達情況

2.2 膿毒癥組存活與死亡患者外周血Beclin-1、Atg5表達水平比較

與存活患者比較，膿毒癥組死亡患者外周血Beclin-1、Atg5表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 外周血Beclin-1、Atg5預測膿毒癥患者預后的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析

按照膿毒癥組外周血Beclin-1、Atg5表達水平的中位數將其分為高表達和低表達患者，經Kaplan-Meier曲線分析，與Beclin-1、Atg5低表達患者比較，高表達患者的28 d累積生存率明顯增加(P<0.05)。繪制外周血Beclin-1、Atg5表達預測膿毒癥患者預后的ROC曲線，曲線下面積分別為0.611(95%CI：0.512～0.709，P=0.030)、0.626(95%CI：0.532～0.720，P=0.013)，見圖2。

表1 兩組外周血Beclin-1、Atg5表達水平比較

2.4 膿毒癥組存活與死亡患者臨床資料比較

與膿毒癥組存活患者比較，死亡患者的性別、年齡、高血壓、冠心病、糖尿病、白細胞計數、血紅蛋白、血小板計數、清蛋白、C反應蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)，但NLR、PLR、MLR、血肌酐、降鈣素原、APACHEⅡ明顯增加(P<0.05)，見表3。

表2 膿毒癥組存活與死亡患者外周血Beclin-1、Atg5表達水平比較

2.5 膿毒癥預后的COX回歸分析

以膿毒癥預后作為因變量，以存活與死亡患者比較差異有統計學意義的因素作為自變量進行COX回歸分析。結果顯示：NLR、MLR、Beclin-1、Atg5、APACHEⅡ是膿毒癥預后的影響因素(P<0.05)，見表4。

A：Kaplan-Meier曲線；B：ROC曲線；C：Kaplan-Meier曲線；D：ROC曲線。

表3 膿毒癥組存活與死亡患者臨床資料比較

表4 膿毒癥預后的COX回歸分析

2.6 外周血Beclin-1與Atg5聯合指標預測膿毒癥預后的logistic回歸與ROC曲線聯合分析

在logistic回歸模型中生成Beclin-1聯合Atg5預測膿毒癥組患者預后的新指標為2.426-2.456×Beclin-1-2.566×Atg5，繪制Beclin-1與Atg5聯合指標預測膿毒癥組患者預后的ROC曲線，曲線下面積為0.672(95%CI：0.582～0.762，P=0.001)，見圖3。

圖3 Beclin-1與Atg5聯合指標預測膿毒癥組患者預后的ROC曲線

3 討 論

近些年膿毒癥的臨床救治進展迅速，1 h內使用抗生素、早期液體復蘇、多器官功能支持等治療手段的應用使膿毒癥的死亡率明顯降低。盡管如此，老年膿毒癥患者的救治難度仍較大，受到基礎疾病多、免疫力低下等因素的影響，患者更易發生多器官功能障礙、死亡率較高。近來越來越多的學者關注到感染后免疫功能抑制對膿毒癥患者預后產生不利影響，闡明免疫抑制發生機制、靶向增強免疫功能可為提高膿毒癥救治成功率提供幫助。

淋巴細胞是在免疫應答中發揮重要作用的一類細胞，多項臨床研究報道淋巴細胞減少、NLR增加與膿毒癥的發生及預后的惡化有關[8-10]。自噬是膿毒癥發病過程中與淋巴細胞減少密切相關的生物學環節，自噬是溶酶體降解蛋白質、細胞器并進行再利用的過程，有利于維持細胞穩態，使細胞在感染、應激等病理因素作用下存活。膿毒癥的兩項動物實驗證實了自噬對淋巴細胞存活的調控作用。WANG等[11]研究顯示激活自噬能夠促進膿毒癥小鼠體內淋巴細胞存活。YING等[12]研究顯示抑制自噬能夠促進膿毒癥小鼠體內淋巴細胞凋亡，提示自噬在膿毒癥發病過程中對淋巴細胞具有保護作用。結合國內相關臨床研究發現的膿毒癥患者淋巴細胞自噬蛋白Beclin-1、Atg5表達減少與預后惡化相關進行分析，膿毒癥發病過程中自噬受抑制不利于其發揮淋巴細胞的保護作用，進而引起淋巴細胞減少、膿毒癥病情加重[5-6]。

本研究以老年膿毒癥患者為對象，分析了自噬與膿毒癥發病及預后的關系。老年膿毒癥患者外周血中Beclin-1、Atg5的表達明顯減少且存活患者外周血中Beclin-1、Atg5的表達明顯高于死亡患者，表明在老年膿毒癥的發病過程中外周血淋巴細胞的自噬受到抑制且死亡患者自噬受抑制的程度更強，其機制可能是自噬受到過度抑制后淋巴細胞存活減少、免疫功能減弱并造成預后惡化。進一步通過Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析Beclin-1、Atg5表達與老年膿毒癥患者預后的關系，隨著Beclin-1、Atg5表達增加，老年膿毒癥患者的28 d累積生存率也相應增加且Beclin-1、Atg5的表達對預后具有預測價值，由此進一步驗證了Beclin-1、Atg5在老年膿毒癥患者病情發展變化中的保護作用。

膿毒癥患者預后的影響因素復雜，國內外多項研究報道NLR、MLR及APACHEⅡ等輔助檢查指標是膿毒癥患者預后的影響因素[13-16]。本研究也對老年膿毒癥患者預后的影響因素進行了分析，結果發現Beclin-1、Atg5、APACHEⅡ與患者預后相關，其中NLR、MLR、APACHEⅡ與預后相關的結果與既往多項研究的報道一致，但APACHEⅡ過程復雜、依賴多項輔助檢查指標，不利于病情的早期評估。Beclin-1、Atg5與預后相關的結果與Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析的結果一致，在此基礎上本研究還分析了兩項指標聯合評價預后的價值，在logistic模型中得到方程后生成Beclin-1聯合Atg5的新指標，經ROC曲線分析：該新指標對老年膿毒癥患者的預后具有預測價值且曲線下面積較單一指標增加，提示聯合指標對老年膿毒癥患者預后的評估價值優于單一指標。

綜上所述，老年膿毒癥患者外周血自噬相關蛋白Beclin-1、Atg5表達減少且與預后惡化有關，Beclin-1聯合Atg5用于評估老年膿毒癥患者的預后具有更優的靈敏度和特異度，一方面為今后評估老年膿毒癥病情、將自噬標志蛋白作為評價預后的標志物提供了依據，另一方面也為今后探明自噬在膿毒癥發病中的作用機制、發現通過自噬治療膿毒癥的新手段提供了思路。但本研究的樣本量相對較少，仍需在今后的研究中繼續增加樣本量來尋找更優的截斷值以提高聯合檢測的靈敏度和特異度。