毛秀才INW-Ⅰ對MC3T3-E1細胞增殖和分化的影響及分子機制研究

李 興，吳陳朋，劉 玉，曾憲靈，陳端忠，彭小珍★

（1. 湖南醫藥學院公共衛生與檢驗醫學院，湖南 懷化 418000 ；2. 湖南醫藥學院醫學院，湖南 懷化 418000）

毛秀才又名顯脈旋覆花Inula nervosa Wall.，為菊科旋覆花屬植物，主要產于我國四川西部、云南北部至南部、貴州西部、廣西西部及湖南懷化地區[1-2]。侗藥記載，毛秀才具有祛風寒、通經絡、消積止痛等功效，尤其在治療跌打損傷、骨折方面有很好的療效，且其無毒副作用[3]。但目前關于毛秀才治療骨折作用機制及分子機制的研究較少。本研究以小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆14（MC3T3-E1 subclone 14）為細胞模型，檢測毛秀才二氯甲烷部位（INW- Ⅰ）對MC3T3-E1 細胞活性的影響，同時驗證毛秀才INW- Ⅰ對該細胞細胞外信號調節激酶（ERK1/2）和骨形態發生蛋白9（BMP-9）mRNA 及蛋白表達的影響，為毛秀才的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

毛秀才（ 采集于湖南懷化雪峰山）；MC3T3-E1 細胞（ 購于中國科學院上海細胞庫）；胎牛血清（FBS）（購于美國HyClone 公司）；高糖DMEM 培養基（購于美國Gibco 公司）；CCK-8 試劑盒（購于中國Procell 公司）；ERKI/2、BMP-9 抗體和二抗（購于英國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛秀才INW- Ⅰ的提取 用95% 的乙醇提取獲得毛秀才總浸膏，依次用石油醚、二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯對毛秀才總浸膏進行萃取，分別獲得毛秀才石油醚部位、INW- Ⅰ、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位。將毛秀才INW- Ⅰ凍干后獲得INW- Ⅰ粉末，置于-20℃的冰箱中保存備用。

1.2.2 MC3T3-E1 細胞的培養 培養基為10% 的FBS+ 高糖DMEM 培養基，培養環境為37℃、5%的CO2培養箱。

1.2.3 MC3T3-E1 細胞活性的檢測 采用CCK-8試劑盒檢測MC3T3-E1 細胞的活性，將細胞接種于96 孔板內（5000 個細胞/ 孔），建立對照組和INW- Ⅰ藥物組。INW- Ⅰ藥物濃度為：100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL。孵育24 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，1 h 后用酶標儀檢測（檢測波長為450 nm）其光密度（OD）值，并檢測每組細胞的相對活性。根據檢測結果，確定500 μg/mL 為最佳濃度。將MC3T3-E1 細胞分為對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組和BMP-9 抑制劑Noggin 組。檢測各組MC3T3-E1 細胞的活性，具體的檢測方法同上。

1.2.4 MC3T3-E1 細胞mRNA 表達水平的檢測提取MC3T3-E1 細胞的RNA，操作步驟是：吸走培養基，用預冷的PBS 清洗2 次，在對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126組、BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1 細胞培養皿中分別加入1 mL 的Trizol，靜置10 min 后加入200 μL 的氯仿，上下顛倒后靜置5 min。以12 000 rpm 的轉速進行15 min 的離心處理，取上清液。將上清液滴入另一支新的EP 管中，加入200 μL 的異丙醇，靜置10 min 后以12 000 rpm的轉速進行15 min 的離心處理。棄去上清液，加入75% 的乙醇，以12 000 rpm 的轉速進行10 min的離心處理。棄去上清液，用濾紙吸走杯壁上的液體，加入20 μL 的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，測定RNA 的濃度。逆轉錄：具體的操作方法參照試劑盒的說明書。聚合酶鏈式反應（PCR）：反應所需的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體的引物序列見表1。反應體系及操作步驟參照試劑盒的說明書。

表1 引物序列

1.2.5 MC3T3-E1 細胞中p-ERK1/2、BMP-9 蛋白表達水平的檢測 將對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1 細胞經RIPA 裂解液裂解后，以12 000 rpm 的轉速在4 ℃下進行30 min 的離心處理，取上清液，采用蛋白質定量（BCA）法測定上清液中p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的濃度。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分離上清液中的p-ERK1/2、BMP-9 蛋白，分別孵育一 抗p-ERK1/2（1:1000）、BMP-9（1:1000）、Tubulin（1:1000）和二抗。

1.3 觀察指標

觀察不同濃度的毛秀才INW- Ⅰ對MC3T3-E1 細胞活性的影響。觀察毛秀才INW-Ⅰ、ERK1/2 抑制劑U0126 和BMP-9 抑制劑Noggin 對MC3T3-E1 細胞活性的影響。觀察對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1細胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 及p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的表達情況。

1.4 統計學方法

用SPSS 17.0 軟件處理本研究中的數據，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的毛秀才INW-Ⅰ對MC3T3-E1細胞活性的影響

各組（對照組和不同濃度的INW- Ⅰ組）MC3T3-E1 細胞在培養24 h 后，采用CCK-8 試劑盒檢測其OD 值，結果顯示，不同濃度INW- Ⅰ組MC3T3-E1 細胞的OD 值均高于對照組MC3T3-E1 細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。在濃度為100 ～500 μg/mL 的范圍內，毛秀才INW- Ⅰ的濃度越高MC3T3-E1 細胞的OD 值越大，組間相比差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1。這說明，濃度為100 ～600 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ均能提高MC3T3-E1 細胞的活性，促進其增殖，且500 μg/mL 這一濃度是促進MC3T3-E1 細胞增殖最適宜的濃度。

圖1 不同濃度毛秀才INW-Ⅰ對MC3T3-E1 細胞活性的影響

2.2 500μg/mLINW-Ⅰ、U0126 及Noggin對MC3T3-E1 細胞活性的影響

各組（ 對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin組）MC3T3-E1 細胞在培養24 h 后，采用CCK-8試劑盒檢測其OD 值，結果顯示，500 μg/mL INW- Ⅰ組MC3T3-E1 細胞的活性顯著高于對照組，ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1 細胞的活性均低于對照組， 其中BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1細胞的活性最低，組間相比差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖2。這說明，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ可顯著提高MC3T3-E1 細胞的活性，BMP-9 抑制劑Noggin 和ERK1/2 抑制劑U0126 均可抑制MC3T3-E1 細胞的活性，且BMP-9 抑制劑Noggin 對MC3T3-E1 細胞活性的抑制效果最強。

圖2 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126 及Noggin 對MC3T3-E1 細胞活性的影響

2.3 各組MC3T3-E1 細胞中ERK1/2 和BMP-9mRNA 的表達

各組（ 對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin組）MC3T3-E1 細胞在培養24 h 后，分別觀察其ERK1/2 和BMP-9 mRNA 的表達水平， 結果顯示，500 μg/mL INW- Ⅰ組MC3T3-E1 細胞中ERK1/2 mRNA 的表達水平高于對照組，ERK1/2 抑制劑U0126 組MC3T3-E1 細胞中ERK1/2 mRNA 的表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見圖3A；500 μg/mL INW- Ⅰ組MC3T3-E1 細胞中BMP-9 mRNA 的表達水平高于對照組，BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1 細胞中BMP-9 mRNA 的表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見圖3B。這說明，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ對MC3T3-E1 細胞中ERK1/2 和BMP-9 mRNA 的表達均有顯著的促進作用，ERK1/2 抑制劑U0126對MC3T3-E1 細胞中ERK1/2 mRNA 的表達具有顯著的抑制作用，BMP-9 抑制劑Noggin 對MC3T3-E1 細胞中BMP-9 mRNA 的表達具有顯著的抑制作用。

圖3 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126 及Noggin 對MC3T3-E1 細胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 表達的影響

2.4 各組MC3T3-E1 細胞中p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表達

各 組（ 對 照 組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin 組）MC3T3-E1 細胞在培養24 h 后，對其p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表達水平進行檢測，結果顯示，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ可促進MC3T3-E1 細胞中p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表達，而ERK1/2 抑制劑U0126 可抑制MC3T3-E1細胞中p-ERK1/2 蛋白的表達，BMP-9 抑制劑Noggin 可抑制MC3T3-E1 細胞中BMP-9 蛋白的表達。詳見圖4A、4B。

圖4 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126、Noggin 對MC3T3-E1 細胞中p-ERK1/2和BMP-9 蛋白表達的影響

3 討論

骨折的愈合是一個極其復雜的組織學、生物學、內分泌學、生物力學修復的過程。受諸多因素的影響，骨折患者可發生骨折延遲愈合或不愈合[4]。據不完全統計，有5% ～10% 的骨折患者會由于各種原因而發生骨折延遲愈合或不愈合[5]。研究指出，術后骨折區域血液循環不暢引發的局部血腫、水腫是導致骨折延遲愈合或不愈合的主要原因[6]。因此，尋找一種有效促進骨折愈合的藥物十分重要。本研究的結果顯示，100 ～500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ均能有效提高MC3T3-E1 細胞的活性，且隨著毛秀才INW- Ⅰ濃度的增加，MC3T3-E1 細胞的活性越高。這說明，毛秀才INW- Ⅰ能提高成骨細胞的活性，促進其增殖。EKR 信號通路是骨細胞增殖和分化的重要通路[7]。臨床上普遍認為BMP-2、BMP-4、BMP-7 和BMP-9 具有很強的誘導成骨能力，其中BMP-9 是目前發現誘導成骨能力最強的成骨因子。本研究中我們檢測了MC3T3-E1 細胞中ERK1/2 和BMP-9 mRNA、蛋白的表達情況，發現500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ對MC3T3-E1細胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 及p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的表達均有促進作用。

綜上所述，毛秀才INW-Ⅰ可提高MC3T3-E1細胞的活性，促進其增殖。毛秀才INW-Ⅰ可能是通過上調MC3T3-E1 細胞中p-ERK1/2 和BMP-9 的表達而促進細胞的增殖和分化。