檢測IgH基因重排殘留量在多發(fā)性骨髓瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值

陳炎添，張雅西，郭翼華，蘇雪棠

（江門市人民醫(yī)院1. 檢驗(yàn)科 2. 血液科，廣東 江門 529020）

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種以產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白的異常漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)惡性增殖為主要特征的B 細(xì)胞系惡性腫瘤。近年來，以沙利度胺、硼替佐米等為代表的新藥不斷出現(xiàn)，使得MM 患者的總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）得到延長。此病患者經(jīng)誘導(dǎo)治療其病情可達(dá)到完全緩解（CR），但一些患者會出現(xiàn)微小殘留病變（MRD）。目前臨床上主要是依靠骨髓細(xì)胞形態(tài)分析來判斷MM 患者的治療效果[1]。但當(dāng)此病患者骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)量處于微小殘留量時(shí)，對其進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)分析就會出現(xiàn)一定的局限性，很難通過骨髓細(xì)胞形態(tài)分析來判斷其是否需要繼續(xù)接受治療，從而易導(dǎo)致其病情復(fù)發(fā)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在MM 發(fā)生發(fā)展的過程中伴隨著多種特異的細(xì)胞遺傳學(xué)層次上的相關(guān)基因數(shù)目或結(jié)構(gòu)的改變，主要以免疫球蛋白重鏈（IgH）基因重排為主[2]。本研究通過采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測MM 患者的IgH 基因重排殘留量，探討MM患者經(jīng)治療后病情復(fù)發(fā)的可能性及IgH 基因重排殘留量與MRD 的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2021 年5 月期間我院收治的65 例MM 患者作為研究對象。其病情均符合MM 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，且均自愿參與本研究。在這些患者中，有男38 例，女27 例；其年齡為41 ～78 歲，平均年齡為（61.56±8.21）歲；其中，初診患者有18 例，定期入院接受化療的患者有47 例；免疫球蛋白分型為IgG 型的患者有52 例，為IgA 型的患者有6 例，為IgM 型的患者有5 例，為IgE型的患者有2 例。

1.2 材料

7500 Real Time PCR System 基 因 擴(kuò) 增儀（ 美 國ABI 公 司 生 產(chǎn) ），Genomic DNA Purification Kit 試劑盒。IgH 通用PCR 引物：VH 5’-ACACGGCCGTGTATTACTGT-3’，JH 5’-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3’[4]。每次試驗(yàn)均設(shè)一陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品為K562 細(xì)胞株（慢性粒細(xì)胞白血病急性變細(xì)胞系），陽性對照品為U266 細(xì)胞株（MM 細(xì)胞系）。K562 細(xì)胞株和U266 細(xì)胞株經(jīng)PBS 緩沖液洗滌后可直接提取DNA。

1.3 治療方法

采用VMP 方案（硼替佐米+ 馬法侖+ 潑尼松）對本研究中65 例患者進(jìn)行化療，共進(jìn)行6 個(gè)周期的化療。

1.4 IgH 基因PCR 擴(kuò)增的步驟

溶解所需試劑，振蕩混勻后進(jìn)行1 min 的離心處理。配置反應(yīng)體系，包括上游引物：0.3 μL，下游引物：0.3 μL，模板DNA ：2 μL，SYBR Green I Real time PCR Master Mix ：6.75 μL，雙蒸水：5.65 μL，總體積為15 μL。將上述反應(yīng)體系在RT-PCR 儀中進(jìn)行PCR 反應(yīng)，按反應(yīng)條件在95℃下預(yù)變性10 min，在95℃下變性15 s，在57 ℃下退火20 s，在68 ℃下延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)。完成PCR 循環(huán)后作融解曲線分析，95℃15 s，55℃15 s，95℃15 s，融解曲線的峰值為86.4℃，利用融解曲線可將特異產(chǎn)物和非特異產(chǎn)物分開。

1.5 骨髓細(xì)胞形態(tài)涂片檢查

染液選用瑞氏- 姬姆薩染液（由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），所有患者均于髂前上棘部位采集骨髓，抽取骨髓0.2 ～0.5 mL，并迅速進(jìn)行涂片。選取厚薄適中且有骨髓小粒的骨髓涂片進(jìn)行染色，在低倍鏡及油鏡下分類計(jì)數(shù)200 個(gè)有核細(xì)胞，觀察其中是否有骨髓瘤細(xì)胞并計(jì)數(shù)。患者經(jīng)治療達(dá)到臨床完全緩解（CCR）后病情復(fù)發(fā)的診斷依據(jù)是其骨髓涂片中骨髓瘤細(xì)胞的比例超過5%。

1.6 觀察指標(biāo)

觀察65 例患者經(jīng)6 個(gè)周期的化療后其病情的緩解情況。將其病情的緩解情況分為CCR、部分緩解（PR）和未緩解（NR）。觀察經(jīng)治療達(dá)到CCR 的患者IgH 基因重排呈陽性的情況。觀察65例MM 患者中不同免疫球蛋白分型患者的IgH 基因重排拷貝數(shù)與骨髓瘤細(xì)胞比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用% 表示，用χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 65 例患者治療后病情的緩解情況

本研究中65 例患者經(jīng)6 個(gè)周期的化療后，其中病情達(dá)到CCR 的患者有54 例，達(dá)到PR 的患者有9 例，NR 的患者有2 例。

2.2 經(jīng)治療達(dá)到CCR 的54 例患者IgH 基因重排呈陽性的情況

在經(jīng)治療達(dá)到CCR 的54 例患者中，有31 例患者的IgH 基因重排呈陽性。這31 例患者在治療前及經(jīng)治療達(dá)到CCR 后，其IgH 基因重排拷貝數(shù)無顯著變化（P＞0.05），其骨髓瘤細(xì)胞的比例有顯著變化（P＜0.01）。詳見表1。將這31 例IgH基因重排呈陽性的患者重新分為兩組，一組為繼續(xù)治療組（n=16），一組為停止治療組（n=15）。繼續(xù)治療組患者一直治療到IgH 基因重排轉(zhuǎn)陰為止，其中部分患者最長延長了5 個(gè)治療周期，治療后繼續(xù)治療組患者的病情均未復(fù)發(fā)。停止治療組患者在停止治療后，其病情均復(fù)發(fā)。這說明，經(jīng)治療達(dá)到CCR 的MM 患者，若其IgH 基因重排呈陽性，則其病情復(fù)發(fā)的可能性會大大增加。

表1 經(jīng)治療達(dá)到CCR 的54 例患者中31 例IgH 基因呈陽性患者的情況

2.3 65 例MM 患者中不同免疫球蛋白分型患者的IgH 基因重排拷貝數(shù)與骨髓瘤細(xì)胞的比例

在65 例不同免疫球蛋白分型的MM 患者中，免疫球蛋白分型為IgG 型和IgA 型的患者經(jīng)治療達(dá)到CCR 后，其IgH 基因重排拷貝數(shù)偏高；免疫球蛋白分型為IgG 型、IgA 型、IgM 型、IgE 型的患者經(jīng)治療達(dá)到CCR 后，其骨髓瘤細(xì)胞的比例均偏低。詳見表2。結(jié)合表2 和表3 不難發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白分型為IgG 型和IgA 型的MM 患者經(jīng)治療達(dá)到CCR 后，其病情更易復(fù)發(fā)。

表2 65 例MM 患者中不同免疫球蛋白分型患者的IgH 基因重排拷貝數(shù)與骨髓瘤細(xì)胞的比例

3 討論

本研究中65 例MM 患者采用VMP 方案進(jìn)行治療后，取得了很好的療效。此病患者經(jīng)治療病情可達(dá)到CR，但由于MRD 的存在，可導(dǎo)致其體內(nèi)的IgH 基因出現(xiàn)微小殘留，IgH 基因會不斷復(fù)制，當(dāng)復(fù)制到一定數(shù)量時(shí)，就會導(dǎo)致患者的病情復(fù)發(fā)。目前臨床上主要是依靠骨髓細(xì)胞形態(tài)分析來評估MM 患者的臨床療效。但對此病患者進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)分析具有一定的局限性，無法準(zhǔn)確地評估其是否應(yīng)繼續(xù)接受治療，易導(dǎo)致其病情復(fù)發(fā)。在MM 的發(fā)病機(jī)制中，IgH 基因重排作為新的研究方向，在國內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后MM 患者的IgH 基因重排拷貝數(shù)若降到50 以下，其病情可達(dá)到CR。對于治療后IgH 基因重排拷貝數(shù)小于50 的患者，每隔一段時(shí)間檢測其IgH基因重排拷貝數(shù)可作為監(jiān)測其病情復(fù)發(fā)及進(jìn)展的手段之一。對于病情達(dá)到CR 的患者，若其IgH基因重排拷貝數(shù)未轉(zhuǎn)為陰性，仍需繼續(xù)接受治療。在治療期間利用RT-PCR 技術(shù)檢測患者的IgH 基因重排殘留量可作為評估其療效和預(yù)后及監(jiān)測MRD 的參考指標(biāo)之一[6]。本研究的結(jié)果表明，IgH基因重排拷貝數(shù)與MM 的免疫球蛋白分型有關(guān)，IgG 型MM 患者的IgH 基因重排拷貝數(shù)高于其他免疫球蛋白分型患者。從本研究中的表1 可以看出，骨髓內(nèi)骨髓瘤細(xì)胞的比例與IgH 基因重排拷貝數(shù)有相關(guān)性，IgH 基因重排拷貝數(shù)越高，骨髓內(nèi)骨髓瘤細(xì)胞的比例就越高。經(jīng)治療病情達(dá)到CR的MM 患者，若其骨髓瘤細(xì)胞的比例達(dá)到CR 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，而IgH 基因重排拷貝數(shù)呈陽性，說明對其進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)分析難以檢測出MRD，應(yīng)通過檢測IgH 基因重排殘留量評估其療效[7]。

綜上所述，采用RT-PCR 法檢測MM 患者治療后的IgH 基因重排殘留量能指導(dǎo)臨床治療，有助于預(yù)防其病情復(fù)發(fā)，提高其臨床療效。