外標法與主成分校正因子法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質含量的價值對比

吳健龍，關 東，呂海亮，黃 松，杜 偉，陳亞軍★，謝 斌★

（1. 武漢科技大學藥學系，湖北 武漢 430065 ；2. 珠海潤都制藥股份有限公司，廣東 珠海 519041）

纈沙坦氨氯地平片是一種復方降壓藥，其主要成分為纈沙坦和苯磺酸氨氯地平。纈沙坦為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，苯磺酸氨氯地平為鈣離子通道阻斷劑。纈沙坦氨氯地平片主要用于治療輕中度高血壓[1]，也可用于治療高血壓合并其他疾病，如高血壓合并糖尿病[2]。與單用纈沙坦或苯磺酸氨氯地平治療高血壓相比，用纈沙坦聯合苯磺酸氨氯地平治療此病的效果更好，能有效控制患者的血壓[3-4]。纈沙坦氨氯地平片為復方制劑，其中含有的雜質由已知雜質和未知雜質組成。為了達到有效控制纈沙坦氨氯地平片質量的目的，本試驗參考41 版《美國藥典》[5]，分別采用高效液相色譜（HPLC）外標法與主成分校正因子法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質在不同濃度中的含量，比較其回收率。本試驗規定的纈沙坦氨氯地平片中的已知雜質為纈沙坦水解雜質、纈沙坦乙酯、氨氯地平有關物質A 和纈沙坦雜質B，但對纈沙坦雜質B 不要求進行含量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀，包含在線脫氣機、四元高壓泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器；XPR6UD5/A、XSR105/A 型電子天平。

1.2 試藥

纈沙坦對照品（生產廠家：珠海潤都制藥股份有限公司；批號：191202 ；含量：99.3%）；苯磺酸氨氯地平對照品（生產廠家：中國食品藥品檢定研究院；批號：100374-201605 ；含量：100.0%）；纈沙坦氨氯地平片（生產廠家：珠海潤都制藥股份有限公司；批號：20200701、20210301）；纈沙坦雜質B（生產廠家：廣州雋沐生物科技股份有限公司；批號：DM19032510 ；含量：97.83%）；纈沙坦水解雜質（ 生產廠家：廣州雋沐生物科技股份有限公司；批號：DM19011033 ；含量：99.49%）；纈沙坦乙酯（生產廠家：廣州雋沐生物科技股份有限公司；批號：DM18070911 ；含量：99.22%）；富馬酸氨氯地平有關物質A（生產廠家：廣州雋沐生物科技股份有限公司；批號：DM18071201 ；含量：99.31%）；纈沙坦氨氯地平片（生產廠家：珠海潤都制藥股份有限公司；批號：20200701）；空白輔料（生產廠家：珠海潤都制藥股份有限公司；批號：PXA-1202008049）。甲醇、乙腈為色譜純，三乙胺、磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 HPLC 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（WatersSymmetryC18，150 mm×3.9 mm，5μm）。流動相A：取三乙胺10 mL 加水至1000 mL，用磷酸調節pH 值至2.8。流動相B：甲醇-乙腈（7:3，V/V）。洗脫梯度見表1。檢測波長：237 nm。進樣量：10 μL。流速：1.0 mL/min。柱溫：30℃。進樣溫度：10℃。

表1 洗脫梯度

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶液/ 稀釋液 將流動相A 與流動相B等比例混合，即制得空白溶液/ 稀釋液。

2.2.2 對照品溶液 取纈沙坦、苯磺酸氨氯地平、已知雜質對照品（纈沙坦水解雜質、纈沙坦乙酯、富馬酸氨氯地平有關物質A 對照品），用稀釋液分別配制成纈沙坦溶液（濃度為0.32 μg/mL）、氨氯地平溶液（濃度為0.20 μg/mL）、纈沙坦水解雜質溶液（濃度為0.32 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.32 μg/mL）、氨氯地平有關物質A 溶液（濃度為0.5 μg/mL），即制得對照品溶液。氨氯地平與苯磺酸氨氯地平的換算因子為0.721（408.88/567.05），氨氯地平相關物質A 與富馬酸氨氯地平相關物質A 的換算因子為0.778（406.86/522.94）。

2.2.3 供試品溶液 取供試品（纈沙坦氨氯地平片）10 片，置于500 mL 的量瓶中，加稀釋液溶解后進行定容、離心處理，取上清液作為氨氯地平供試品溶液，取上清液稀釋10 倍作為纈沙坦供試品溶液。

2.2.4 加樣供試品溶液 分別取供試品2 片、各已知雜質對照品適量，置于100 mL 的量瓶中，加稀釋液溶解，定容至刻度，分別配制成纈沙坦水解雜質溶液（濃度為1.6 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為1.6 μg/mL）、氨氯地平相關物質A 溶液（濃度為2.5 μg/mL）。對上述溶液進行離心處理，取上清液作為氨氯地平加樣供試品溶液，取上清液稀釋10 倍作為纈沙坦加樣供試品溶液。

2.2.5 系統適用性溶液 取各已知雜質對照品適量，制成含纈沙坦雜質B0.08 mg/mL、纈沙坦0.16 mg/mL、氨氯地平0.10 mg/mL 的溶液，即制得系統適用性溶液。

2.2.6 空白輔料溶液 取空白輔料95 mg，置于50 mL 的量瓶中，用稀釋液溶解，定容至刻度后進行離心處理，取上清液作為空白輔料溶液。

2.2.7 線性儲備溶液 取纈沙坦、苯磺酸氨氯地平、已知雜質對照品，用稀釋液分別配制成纈沙坦溶液（濃度為3.2 μg/mL）、氨氯地平溶液（濃度為2.0 μg/mL）、纈沙坦水解雜質溶液（濃度為3.2 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為3.2 μg/mL）、氨氯地平相關物質A 溶液（濃度為5.0 μg/mL），即制得線性儲備溶液。

2.2.8 雜質定位溶液 取已知雜質對照品適量，分別配制成纈沙坦水解雜質溶液（濃度為0.32 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.32 μg/mL）和氨氯地平相關物質A 溶液（濃度為0.5 μg/mL），即制得雜質定位溶液。

2.2.9 已知雜質回收率溶液 分別取已知雜質對照品適量與本品4 片，置于200 mL 的量瓶中，分別配制成纈沙坦水解雜質溶液（濃度為0.800 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.795 μg/mL）、氨氯地平有關物質A 溶液（濃度為0.052 μg/mL），將其作為定量限（Limit of Quantitation，LOQ）回收率溶液。同法配制成纈沙坦水解雜質溶液（濃度為0.16 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.16 μg/mL）、氨氯地平相關物質A 溶液（濃度為0.25 μg/mL）作為50% 回收率溶液。同法配制成纈沙坦水解雜質溶液（濃度為0.32 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.32 μg/mL）、氨氯地平相關物質A溶液（濃度為0.5 μg/mL）作為100% 回收率溶液。同法配制成纈沙坦水解雜質溶液（濃度為0.48 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.48 μg/mL）、氨氯地平相關物質A 溶液（濃度為0.75 μg/mL）作為150% 回收率溶液。以上溶液各配制3 份。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適應性 精密量取“2.2”項下的系統適用性溶液10 μL，按“2.1”項下的色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。色譜圖見圖1。進行系統適應性試驗的結果顯示，系統適用性溶液中的其他成分對測定結果無干擾。

圖1 系統適應性試驗圖譜

2.3.2 選擇性考察 精密量取“2.2”項下的空白溶液、空白輔料溶液、雜質定位溶液、供試品溶液與加樣供試品溶液各10 μL，以空白溶液作對比，按“2.1”項下的色譜條件進行HPLC 檢測。檢測的結果顯示，空白溶液、空白輔料對檢測結果無干擾；供試品溶液、加樣供試品溶液中各峰的分離度均≥1.5，纈沙坦、氨氯地平的峰純度均為1000.0。這表明本檢測方法的選擇性良好。

2.3.3 強降解試驗

2.3.3.1 破壞試驗 取纈沙坦氨氯地平片2 片分別置于100 mL 的容量瓶中，加水10 mL 使其崩解，并按如下條件進行破壞試驗：1）酸：加1.0 mol/L 的鹽酸溶液10 mL，放置20 h。2）堿：加1.0 mol/L 的氫氧化鈉溶液10 mL，放置30 min。3）氧化：加30% 的過氧化氫溶液10 mL，放置90 min。4）光照：在照度為（4500lx±500lx）的光照箱中放置9 d。5）高溫：在80℃下放置140 h。完成上述操作后，將樣品放冷并將其pH 調至中性，加稀釋液至刻度線定容，搖勻后進行離心處理，取上清液按“2.1”項下的色譜條件進行測定。檢測結果見圖2。進行破壞試驗的結果表明，纈沙坦氨氯地平片經強酸、強堿、氧化、高溫和光照破壞后，雜質峰數目和面積顯著增加；所有雜質峰均能與氨氯地平峰、纈沙坦峰完全分離。這表明本檢測方法的專屬性良好。

圖2 強降解試驗結果

2.3.3.2 雜質歸屬 分別取2 片纈沙坦氨氯地平片當量苯磺酸氨氯地平原料藥、纈沙坦原料藥、輔料，將其分別混合后得到待檢品苯磺酸氨氯地平原料藥、纈沙坦原料藥、氨氯地平原料藥+ 輔料、纈沙坦原料藥+ 輔料。每種待檢品均按照“2.3.3.1”項下的方法進行破壞試驗并實施HPLC 檢測，將檢測結果與“2.3.3.1”項下的結果對比即得到雜質歸屬。詳見表2。

表2 纈沙坦氨氯地平片的雜質歸屬

2.3.4 LOQ、檢測限與線性關系考察 配制各物質濃度為對照品溶液3 倍的LOQ 儲備液，取一定量的LOQ 儲備液，用稀釋液逐步進行稀釋，至信噪比≥10:1，搖勻即得到LOQ 溶液。精密量取檢測限（limit of detection，LOD）溶液3 mL，置于10 mL的量瓶中，用流動相A 稀釋至刻度并搖勻。精密量取LOQ 溶液與LOD 溶液各10 μL，按“2.1”項下的色譜條件進行HPLC 檢測。分別精密量取

線性儲備液5 mL、8 mL、10 mL、12 mL、15 mL，置于100 mL 的容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，配制成濃度為50%、80%、100%、120%、150%的線性溶液。精密量取各線性溶液10 μL，按“2.1”項下的色譜條件進行HPLC 檢測，以峰面積為縱坐標，以進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程及線性范圍見表3。

表3 回歸方程及線性范圍

2.3.5 重復性試驗 取同一批號的供試品（批號為20200701），按照“2.2”項下的方法配制成纈沙坦加樣供試品溶液、氨氯地平加樣供試品溶液，平行配置6 份。精密量取各加樣供試品溶液10 μL，按“2.1”項下的色譜條件進行HPLC 測定。檢測的結果顯示，氨氯地平相關物質A、纈沙坦水解雜質、纈沙坦乙酯峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為3.82%、4.27%、3.72%，其他單個雜質未檢出。這表明本檢測方法的重復性良好。

2.3.6 溶液穩定性 按照“2.2”項下的方法配制加樣供試品溶液與對照品溶液，將上述兩種溶液在10℃的環境中儲存一定時間，分別在放置0 h、24 h、48 h 后精密量取溶液10 μL，按照“2.1”項下的色譜條件進行HPLC 檢測，測試加樣供試品溶液與對照品溶液在10℃環境中的穩定性。檢測的結果表明，加樣供試品溶液與對照品溶液在10℃的環境中放置48 h 的穩定性良好。

2.4 主成分校正因子法

2.4.1 相對校正因子 按照“2.3.4”項下的線性關系考察試驗，在不同人員、儀器、色譜柱條件下重復檢測2 次，根據所得線性關系式按照雜質歸屬計算相對校正因子。相對校正因子=（主成分斜率/ 雜質斜率）。取2 次線性關系考察校正因子的均值作為實際校正因子f，結果見表4。

表4 已知雜質校正因子

2.4.2 不同色譜條件下校正因子法對有關物質的測定 考察色譜條件的變化對纈沙坦氨氯地平片有關物質檢出情況的影響。按照“2.2”項下的方法配制氨氯地平相關物質A、纈沙坦水解雜質、纈沙坦乙酯（濃度分別為0.257 μg/mL、0.1598 μg/mL、0.1736 μg/mL）加樣供試品溶液，考察流動相比例為52:48 和49.5:50.5、柱溫變化為±2℃、流速變化為±0.1 mL/min、不同批次的色譜柱對本品雜質檢測結果及雜質分離度的影響。結果表明，本品雜質的檢測結果不受色譜條件變化的影響，主峰與鄰近雜質峰及已知雜質的分離度良好。上述條件下測得雜質含量與實際含量的絕對變化值為：氨氯地平相關物質A 的絕對變化值為0 ～0.02%，纈沙坦水解雜質的絕對變化值為0 ～0.01%，纈沙坦乙酯的絕對變化值為0。其他未知的單個雜質未檢出，總雜質的絕對變化值為0 ～0.02%。測得雜質含量大于0.05% 雜質峰的個數一致，主峰純度均為1000.0。由此可見，本檢測方法的耐用性良好。

2.5 外標法與主成分校正因子法測定

按照“2.2”項下的方法制備已知雜質回收率溶液，每種濃度平行制備3 份，按照“2.1”項下的色譜條件分別采用外標法與主成分校正因子法進行檢測，重復檢測3 次，得到回收率。取3 次測得回收率的平均值，采用SPSS 軟件對其進行成對樣本t檢驗，結果顯示，采用外標法與主成分校正因子法測得的纈沙坦氨氯地平片中已知雜質的回收率相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 采用外標法與主成分校正因子法測得纈沙坦氨氯地平片中已知雜質回收率的對比

2.6 樣品中雜質含量的測定

分別采用外標法和主成分校正因子法對纈沙坦氨氯地平片中的已知雜質進行計算，除去苯磺酸的峰，其他所有未知雜質均參照強降解試驗雜質歸屬表進行雜質歸屬。取2 批樣品（20200701，20210301）按照“2.2”項下的方法制備供試品溶液并進行檢測，結果顯示纈沙坦水解雜質、纈沙坦乙酯和其他單個未知雜質均未檢出。采用外標法進行檢測時，氨氯地平相關物質A 的含量分別為0.034% 和0.030%，單一最大雜質的含量分別為0.034% 和0.030%，總雜質的含量分別為0.034% 和0.030%。采用主成分校正因子法進行檢測時，氨氯地平相關物質A 的含量分別為0.036%和0.030%，單一最大雜質的含量分別為0.036% 和0.030%，總雜質的含量分別為0.036%和0.030%。

3 討論

本試驗的設計參考了《美國藥典》（41 版）和相關的資料、文獻[6-8]。從本試驗的結果可以看出，采用外標法與主成分校正因子法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質回收率的準確性均良好，組間相比差異無統計學意義（P＞0.05）。這說明采用上述兩種方法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質的含量具有良好的可行性和可靠性。但在對纈沙坦氨氯地平片中已知雜質含量的限度考察中，主成分校正因子法減少了對照品的使用量，可實現以主成分為對照品進行纈沙坦氨氯地平片中有關物質含量的測定，在質量評價中能大幅降低測定成本。

綜上所述，外標法與主成分校正因子法均可用于測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質的含量。但采用主成分校正因子法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質的含量更加方便、經濟。