大腸埃希菌密度感應調節子qseC基因失活突變株構建及其生物學特性

周青帥 趙行行 李冬梅 崔古貞 陳崢宏 任瑋 齊曉嵐 洪偉

貴州醫科大學1地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室&貴州省醫學分子生物學重點實驗室，2貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室，3免疫學教研室（貴陽550004）

大腸埃希菌是世界范圍內造成炎癥性腸病高發病率的重要病原體，炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一種容易復發的慢性炎癥性疾病，在IBD 相關的腸道黏膜活檢和糞便標本中可分離出大量致病性大腸埃希菌［1-2］。病原微生物進入血液可引發血流感染（blood strean infection，BSI），BSI中兒童患者高比例檢測出大腸埃希菌，在相關報道中對頭孢曲松耐藥率達到了32.65%，對頭孢他啶耐藥率為8.33%［3］。此外，植入手術后的大腸埃希菌感染成為了常見的醫院內感染，由于大腸埃希菌容易在植入材料上形成生物膜，使得此類感染難以治療［4-5］。部分外科手術中大腸埃希菌成為主要的感染源，且相應出現高耐藥率［6］。

群體感應系統（quorum sensing system，QS）在誘導物作用下調節種群數量和基因表達，使其更好的適應生存環境［7］。QS 在誘導信號分子產生、釋放達到一定的閾值后，細菌受體蛋白感知信號后調節自身基因的表達，改變細菌的表型，包括細菌的毒力、生物膜的形成、運動能力的改變，以及對藥物的抗性等［8-10］。大腸埃希菌密度調節子C（quorum sensingE.coliregulator C，qseC）是典型的革蘭陰性菌中的QS，屬于大腸埃希菌qseBC 雙組分系統，qseC 基因大小約為1.3 kb，編碼組氨酸蛋白激酶，是該雙組分系統中負責感應識別外部信號分子的受體部分［11-12］，有研究人員發現qseC的缺失會干擾qseB的去磷酸化，從而釋放出一個不受控制的正反饋回路，下調毒力基因的表達［13］。在體外，使用qseC抑制劑能阻斷qseBC 的信號傳遞，使用抑制劑LED209 能降低腸出血性大腸埃希菌的毒力［14］。qseC基因在大腸埃希菌毒力扮演著重要的地位，但qseC基因對大腸埃希菌其他表型影響尚未清楚。

二型內含子（Group ⅡIntron）是由核酶活性的RNA 和IEP 蛋白（Intron encoded protein）組成，是可以在基因組中移動的核糖核蛋白復合物（RNPs），被開發為基因靶向失活工具［15-16］。課題組利用嗜熱聚球藻（Thermosynechococcus elongatus）中的TeI3c∕4c 二型內含子，開發了受溫度誘導的基因打靶系統（Thermotargetron 系統）［17］，可在42℃～48℃工作，高效失活靶基因。本研究首先利用Thmotargetron系統，靶向失活大腸埃希菌HMS174 菌株qseC基因，構建其突變株。接下來，測定ΔqesC突變株的生長速率、溶血、生物膜形成、運動能力的變化，以及對酸堿和抗生素抗性等表型變化，加深對qseC基因功能的認識。

1 材料與方法

1.1 培養基及培養條件 大腸埃希菌HMS174 和NEBExpres 感受態細胞均在LB 培養基37 ℃培養，LB 液體培養基配制：酵母提取物（Yeast extract）0.5%，胰蛋白胨（Tryptone）1%，氯化鈉（NaCl）1%，固體培養基中加入1.5%的瓊脂粉（Agar Powder）。用濃度10 μg∕mL的氯霉素篩選大腸埃希菌轉化子。

1.2 主要試劑 高保真DNA 聚合酶和1 kb plus DNA Maker 購自諾唯贊生物科技股份有限公司（Vazyme Biotech，南京），限制性內切酶SpeⅠ-HF和BsiWⅠ-HF 購自New England Biolabs（NEB，北京），PCR 產物回收試劑盒及質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司（TIANGEN，北京）。氯霉素、氨芐青霉素、四環素、阿莫西林、甲硝唑、諾氟沙星等抗生素購自北京索萊寶公司（Solarbio，北京）。瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自北京天根公司，所有引物由生工生物工程股份有限公司合成（Sangon Biotech，上海）。

1.3 打靶引物設計及質粒和菌株 首先獲取目的基因序列，從NCBI 數據庫中下載大腸埃希菌HMS174 的基因組數據，找到打靶的目的基因qseC序列信息。然后根據嗜熱二型內含子TeI3c∕4c Intron識別插入位點的規律（5′-AAnnnnnnnnnnnnnA-3′，n 為ATGC 任意4 種堿基）［17］，設計四條打靶引物。qseC 基因正義鏈第627 位點符合該規律。根據該位點設計4 條打靶引物，分別為qseC627s-IBS12、qseC627s-IBS2s、qseC627s-IBS1a、TeI3c-UNV，詳細的序列信息見表1。本研究所用的菌株和質粒見表2。

表1 本研究所需引物Tab.1 Primers used in this study

表2 本研究所需要的質粒和菌株Tab.2 Plasmids and strains used in this study

1.4 Thermotargetron 打靶載體構建 以pHKTT1A 載體為模版［17］，qseC627s-IBS12∕TeI3c-UNV 和qseC627s-EBS12∕qseC627s-EBS1a 引物對擴增獲得突變的TeI3c∕4c Ⅱ型內含子，該內含子中的IBS12，EBS1 和EBS2 識別序列突變為可特異性識別qseC基因627s 位點的序列。膠回收上一輪PCR 產物，以其為模板、qseC627s-IBS12∕qseC627s-EBS1a 為引物進行PCR 反應，使用T5 exonuclease-dependent assembly（TEDA）將打靶片段與雙酶切回收產物連接將兩個打靶片段連接為完整打靶片段qseC627s-Intron。SpeⅠ-BsiWⅠ雙酶切pHK-TT1A 載體，膠回收5887 bp 片段后與qseC27s-Intron 連接獲得qseC-627s 打靶載體pHK-TT1A-qseC627s。

1.5 突變株篩選和計算打靶效率 將打靶質粒pHK-TT1A-qseC627s 轉化進入HMS174，涂布于LB氯霉素抗性平板（LB-CHL），長出轉化子后將轉化子接種至LB-CHL 液體培養基，培養菌液OD600=0.6時，取1 mL 菌液經48℃培養1 h 后吸取10 μL 稀釋100 倍涂布于氯霉素抗性平板，37℃培養過夜。待長出菌落后使用檢測引物DPqseC-F 和DPqseC-R進行菌落PCR 檢測qseC 基因是否打靶成功（插入失活突變株PCR 條帶比野生性菌株大839 bp）。使用引物為DPjunction-U 和DPjunction-D 將檢測成功的菌株送至上海生工公司進行基因測序。將測序正確的菌株使用陰影平板法進行質粒丟失。

1.6 生長速率測定 將50 μL 野生型HMS174 菌液和ΔqseC突變株菌液接種至5 mL LB 培養基中，220 r∕min，37℃震蕩培養。每隔3 h 測定一次野生型和突變株菌液OD600值，連續測定24 h。此實驗做三次獨立重復，根據測定的數值繪制野生型和突變株的生長曲線。

1.7 溶血能力測定 將野生型HMS174和ΔqseC突變株的單菌落接種至5 mL TSB培養基中，220 r∕min，37 ℃培養24 h，然后12 000 r∕min 離心1 min 收集菌液，用新鮮的TSB 培養基重懸菌液，OD 儀調整OD600至0.1，然后取5 μL 菌液滴在BTSB 平板上（含有5%（V∕V）脫脂綿羊血），37 ℃正置培養24 h 觀察并測量溶血斑的大小。

1.8 生物膜形成測定 將野生型HMS174和ΔqesC突變株單菌落接種至5 mL LB培養基中，220 r∕min，37℃培養過夜，取500 μL 菌液稀釋到4.5 mL 新鮮LB中，220 r∕min，37 ℃培養至OD600為0.8。取200 μL上一步培養菌液至96 孔板中，37 ℃培養24 h，另外以空白的M9培養基作為對照組。小心吸取96孔板中的培養基，用PBS 清洗3 次，用4%的多聚甲醛固定15 mim，結晶紫染色10 min，然后用雙蒸水清洗3 次，室溫干燥后加上200 μL 33%的冰醋酸將結晶紫溶解，用酶標儀測定其OD600值。參照對生物膜判定原則［18］，即空白對照組的平均值加上三倍標準差的值為臨界值（Cut-Off value，DC），D＜DC不黏附，DC＜D＜2DC 為弱黏附，2DC＜D＜3DC 為中等黏附，D＞3DC 為強黏附。

1.9 運動能力測定 參考文獻中的方法［19］，用無菌的牙簽將野生型HMS174 和ΔqesC突變株菌液穿刺至0.4%瓊脂濃度的（W∕V）半固體LB 培養基中，37 ℃培養12 h，觀察菌圈的大小并測量其直徑。形成的菌圈越大，表示該菌的運動越強，形成的菌圈越小則表示該菌的運動能力越弱，以此比較野生型菌株和qseC突變株的運動能力。

1.10 pH 敏感性測定 在玻璃試管中加入5 mL無菌的LB 培養基，使用3 mol∕L 的鹽酸（HCl）和氫氧化鈉（NaOH）調節pH 值。得到pH 值為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 的LB 培養基，分別將野生型菌株和qseC 突變株接種上述培養基，220 r∕min，37 ℃震蕩培養6 h，測量OD600值［20］。

1.11 抗生素敏感性測定 使用連續稀釋法［21］測定野生型菌株和qseC突變株對氯霉素（Chloramphenicol）、氨芐青霉素（Ampicillin）、四環素（Tetracycline）、阿莫西林（Amoxicillin）、甲硝唑（Metronidazole）、諾氟沙星（Norfloxacin）等抗生素的耐藥性。微量瓊脂稀釋法的步驟為：在96 孔板中加入150 μL 的LB 培養基，然后在第一孔設置抗生素濃度為128 μg∕mL，然后連續2 倍稀釋10 次至濃度為0.25 μg∕mL，依次得到的抗生素濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg∕mL，每孔接種10 μL野生型菌液或qseC 突變株菌液。野生型菌株和qseC突變株分別設置3 個重復組，同時添加陰性對照組（只有LB 培養基）和陽性對照組（菌液接種至無抗生素的LB 培養基中）。將96孔板置于37 ℃培養12 h 后，使用酶標儀測定OD600值，統計數據后使用prism 8.0 作抗生素敏感性圖。

1.12 統計學方法 使用prism 8.0 制作統計學圖表，使用獨立樣本t檢驗方法分析是否具有統計學差異，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 突變株篩選和計算打靶效率 在48 ℃誘導基因打靶后，隨機挑取的23 個菌落，菌落PCR 檢測后計算打靶效率為100%（圖1A，野生型vs.失活突變株=1 350 bpvs.2 189 bp）。ΔqseC627s 測序結果，與野生型HMS174 基因組中qseC基因進行序列比對后，表明TeI3c∕4c 內含子（839 bp）成功插入大腸埃希菌基因組qseC627s 位點，測序結果表明qseC基因成功失活（圖1B）。

圖1 突變株篩選及打靶位點測序驗證Fig.1 Mutants screening and verification

2.2 大腸埃希菌HMS174 和ΔqseC627s 生物學特性比較

2.2.1 生長速率變化 如圖2 所示，測定了野生型菌株和qseC627s 的生長動力學差異。野生型菌株和ΔqseC627s 在接種3 h 前生長速率差異不大，在3 h 后野生型的生長速度明顯快于ΔqseC627s。ΔqseC627s 在15 h 后生長進入平穩期，最大OD600值為3.0，野生型菌株在15 h 后仍然繼續生長，OD600達到了4.0 以上，表明了qseC基因失活后菌株的生長速度減慢，且菌株生長達到的最大生物量降低。

圖2 野生型HMS174 和ΔqseC627s 生長速率比較eFig.2 Growth rate of wild-type HMS174 and ΔqseC627s strains

2.2.2 溶血能力變化 如圖3所示，在BTSB平板上野生型HMS174 和ΔqseC627s 溶血能力有差異性。圖3A 黃色箭頭所示，野生型大腸埃希菌HMS174產生了一層顏色略淺的溶血圈，而ΔqseC627s 沒有出現顏色略淺的溶血圈（圖3B）。表明大腸埃希菌HMS174qseC基因與其溶血能力相關，當qseC基因失活后其溶血能力消失。

圖3 野生型HMS174 和ΔqseC627s 溶血能力Fig.3 Hemolytic ability of wild-type HMS174 and ΔqseC627s

2.2.3 生物膜形成能力變化 如圖4 所示，野生型HMS174 的生物膜黏附性為強黏附，ΔqseC627s 的生物膜黏附性也為強黏附，但是ΔqseC627s 和野生型HMS174 相比，生物膜形成減少明顯（P＜0.01），表明qseC基因參與了大腸埃希菌生物膜形成過程，對其生物膜的形成具有正向調節作用。

圖4 野生型HMS174 和ΔqseC627s 生物膜形成能力Fig.4 Biofilm formation of wild-type HMS174 and ΔqseC627s strain

2.2.4 運動能力變化 37 ℃培養12 h 后，野生型大腸埃希菌HMS174 和ΔqseC627s 突變株在平板形成了圓形菌落圈，通過測量兩者菌落圈的直徑，野生型HMS174 和ΔqseC627 突變株直徑分別為（36.67±1.15）mm 和（11±1.0）mm（圖5A），統計學分析野生型大腸埃希菌HMS174 和ΔqseC627s 突變株菌落大小差異極顯著（P＜0.01）。表明qseC可以影響大腸埃希菌HMS174的運動能力（圖5B）。

圖5 野生型HMS174 和ΔqseC627s 運動能力比較Fig.5 Motility of wild-type HMS174 and ΔqseC627s strain

2.2.5 野生型HMS174 和ΔqseC627s 不同pH 耐受能力變化 野生型HMS174 和ΔqseC627s 在pH 值為5 ～8 之間均能生長（圖6），但是ΔqseC627s 的耐受能力較HMS174 降低顯著（P＜0.01）。

圖6 野生型HMS174 和ΔqseC627s pH 耐受性Fig.6 pH tolerance of HMS174 and ΔqseC627s strain

2.2.6 抗生素耐藥性變化 圖7A-圖7F 依次為HMS174 和ΔqseC627s 對于氯霉素等抗生素的耐受性結果。ΔqseC627s 較野生型對氯霉素、氨芐青霉素、四環素、阿莫西林、甲硝唑等抗生素耐受性降低，對諾氟沙星敏感性無明顯變化。

圖7 野生型HMS174 和ΔqseC627s 對6 種抗生素的耐受性測定Fig.7 Resistance of HMS174 and ΔqseC627s to 6 antibiotics

3 討論

大腸埃希菌感染已成為常見的病原微生物感染類型，在腹瀉患者中檢測到大量的腹瀉性大腸埃希菌，該菌已成為主要的腹瀉病原菌［22］。碳青霉烯類抗生素作為治療大腸埃希菌感染首選藥物之一，近年來廣泛的使用，導致大腸埃希菌對此類抗生素耐藥性持續增加［23］。密度感應系統參與微生物發光、產孢、耐藥性、生物膜和毒力因子分泌等生命過程，受到研究者的廣泛關注［24-25］。密度感應系統是一種細菌細胞間的通信機制，包括細胞外誘導劑信號分子的產生、檢測和響應。本研究使用Thermotagetron 系統，成功構建了大腸埃希菌HMS174 密度調節子（qseC）基因失活突變株，通過對比研究野生型菌株與ΔqseC627s 的表型差異，鑒定qseC 基因的生理功能。

我們發現，與野生型菌株相比，ΔqseC627s 突變株的生長能力變弱，溶血能力喪失，運動能力與生物膜形成能力顯著降低，以上表型與大腸埃希菌致病力密切相關，可見qseC基因對大腸埃希菌的致病力具有重要貢獻。革蘭陰性菌的溶血能力受到細菌第六型分泌系統（Type ⅥSecretion Systems，T6SS）的調控，并反饋調節T6SS 系統［26］，qseC基因的缺失可能使T6SS 系統無法分泌溶血蛋白，造成ΔqseC627s 溶血能力消失。在哈維支弧菌（Vibrio harveyi）中群體感應系統影響其鞭蛋白合成［27］，大腸埃希菌的鞭毛是其運動器官和宿主黏附因子，qseC 基因的缺失，可能造成鞭毛蛋白合成受阻，導致其運動能力降低。ΔqseC627s 突變株生物膜形成能力顯著降低，由于生物膜是大腸埃希菌對抗外界環境的保護性結構。生物膜合成受阻，可能是大腸埃希菌對酸堿的耐受性和對抗生素耐受性降低的原因。例如在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中，生物膜與其毒力和耐藥性密切相關［28］。綜上所述，qseC基因失活后，大腸埃希菌致病相關表型減弱、致病力降低，因此qseC基因可作為治療大腸埃希菌感染的潛在靶點。