基于TLR4∕NF-κB信號通路探討益生菌對肝內膽汁淤積大鼠的保護作用

周方 孫波 于志丹 李小芹

河南省兒童醫院（鄭州大學附屬兒童醫院，鄭州兒童醫院）消化科（鄭州450053）

膽汁淤積是一種因膽汁形成、分泌和排泄過程中任一環節出現障礙而引發的臨床綜合征。腸道微生物在肝臟病理生理過程中發揮重要作用，能通過改變腸道通透性、調節膽堿代謝、調節膽汁酸代謝等導致肝臟炎癥和（或）纖維化［1］。臨床上已證明微生態制劑可以作為一種治療手段來恢復腸道菌群的平衡，對緩解膽汁淤積性肝病具有良好的效果，但機制尚不完全明確［2］。本研究應用α-萘異硫氰酸酯（alpha-naphthylisothiocyanate，ANIT）建立大鼠急性肝內膽汁淤積型肝炎模型，探討益生菌通過作用于Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）∕核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號轉導通路治療淤膽性肝病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠40只，體質量（200±20）g，由鄭州大學實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK 豫，2017-0001。

1.2 藥品與試劑 ANIT（美國Sigma 公司，生產批號：N4525-10）；益生菌制劑（復方嗜酸乳桿菌，每片含嗜酸乳桿菌5 × 106CFU，通化金馬藥業集團股份有限公司生產，批號：國家準字H10940114）；所用引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成公司，批號：A001-2），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成公司，批號：A003-1）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司，批號分別為：E-EL-R2856c，E-EL-R0012c，E-EL-R0015c）；總RNA提取試劑盒（北京天根科技生化有限公司，批號：DP431）；逆轉錄及實時熒光定量PCR 試劑盒（日本，TaKaRa 公司，批號分別為：RR037A，RR820A）；全蛋白提取試劑盒（凱基生物科技發展有限公司，批號：KGP250）；兔抗大鼠NF-κB p65 抗體和山羊抗兔IgG-HRP 二抗（英國，Abcam 公司，批號分別為：ab16502，ab205718）；兔抗大鼠GAPDH 抗體（美國，Affinity Biosciences公司，批號：AF7021）；兔抗大鼠TLR4 抗體（美國，Affinity Biosciences公司，批號：AF7017）。

1.3 儀器 貝克曼庫爾特AU680 自動生化分析儀（美國，貝克曼庫爾特公司）；LightCycler 480II 實時熒光定量PCR 儀（瑞士，Roche 公司）。

1.4 動物分組及模型制備 40 只SD 大鼠正常喂養5 d 后按隨機數字表分為正常對照組、模型組、模型+益生菌組、正常+益生菌組，每組10 只。ANIT 用橄欖油配制成15 g∕L；復方嗜酸乳桿菌用生理鹽水配制成1×1010CFU∕L 的混懸液備用。模型+益生菌組和正常+益生菌組給予復方嗜酸乳桿菌5×107CFU∕（kg·d）灌胃14 d，正常對照組和模型組灌服生理鹽水5 mL∕（kg·d），均為1 次∕d，并于實驗第12 天給藥后4 h，模型組和模型+益生菌組按75 mg∕kg 給予ANIT 灌胃1 次建立肝內膽汁淤積模型，正常對照組及正常+益生菌組等量橄欖油處理，第14 天給藥后4 h（模型建立48 h）用100 g∕L 水合氯醛250 mg∕kg 腹腔注射麻醉實驗動物，取血、分離血清，-20 ℃保存備檢；留取肝臟標本，-80 ℃保存。

1.5 血清學指標檢測 將留取的血清交由河南省兒童醫院檢驗科，經全自動生化分析儀測定各組血清中總膽紅素（TBiL）、直接膽紅素（DBiL）、總膽汁酸（TBA）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）。

1.6 肝臟組織中MDA 和SOD 活性含量檢測 黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織中SOD 含量，硫代巴比妥酸比色法檢測MDA 水平。肝臟組織勻漿后根據南京建成公司試劑盒說明書進行操作。

1.7 用ELISA 方法檢測肝臟組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 肝臟組織勻漿后根據試劑盒說明書操作方法，用ELISA 檢測肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量。

1.8 用RT-qPCR檢測肝組織NF-κB、TLR4 mRNA表達水平 于冰上取約100 mg 肝組織按照總RNA提取試劑盒說明進行總RNA 提取，清除殘存的基因組DNA 后，測定其濃度，根據逆轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，并置于-20 ℃保存。進行實時熒光定量PCR 檢測，反應條件：95 ℃預變性30 s，擴增40 個循環（95 ℃5 s，60 ℃20 s）。在PCR反應過程中，設定無cDNA 樣品的空白管作為陰性對照，引物序列見表1。以管家基因GAPDH 為內參，用2-ΔΔCt對各基因的原始拷貝數進行相對定量分析。

表1 實時熒光定量RT-PCR 引物序列Tab.1 The primer sequences for RT-qPCR

1.9 用Western blot 法檢測肝組織NF-κB、TLR4蛋白表達水平 按試劑盒說明提取肝臟組織總蛋白后BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣量均為40 μg，經SDS-PAGE 電泳分離，轉膜，脫脂奶粉封閉，加入目的蛋白NF-κB（1∶2 000）、TLR4（1∶1 000）和內參蛋白GAPDH（1∶5 000）的一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）1 h，ECL 化學發光成像系統成像，AlphaEaseFC 軟件處理系統測定分析結果，判斷各組NF-κB、TLR4蛋白表達水平。

1.10 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清肝功能指標比較 與正常對照組比較，模型組TBA、TBiL、DBiL、AST 和ALT 均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型+益生菌組TBA、TBiL、DBiL、AST 和ALT 均低于模型組（P＜0.05）；正常+益生菌組與正常對照組比較各指標差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組大鼠TBiL、DBiL、ALT、AST 和TBA 結果比較Tab.2 Comparison of TBiL，DBiL，ALT，AST and TBA in rats of each group ±s

表2 各組大鼠TBiL、DBiL、ALT、AST 和TBA 結果比較Tab.2 Comparison of TBiL，DBiL，ALT，AST and TBA in rats of each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別正常對照組模型組模型+益生菌組正常+益生菌組F 值P 值n 10 10 10 10 TBiL（μmol∕L）1.08±0.19 78.36±7.47**59.92±6.32**##1.12±0.26##358.88＜0.001 DBiL（μmol∕L）0.32±0.07 48.13±5.67**42.23±3.03**#0.28±0.05##391.47＜0.001 ALT（U∕L）48.61±6.72 611.24±96.70**386.63±67.26*##52.79±5.86##195.27＜0.001 AST（U∕L）26.83±3.64 425.33±45.98**354.15±34.64**##28.12±2.89##368.49＜0.001 TBA（μmol∕L）8.02±1.47 94.28±8.16**82.27±7.70**#7.93±1.14##205.32＜0.001

2.2 各組肝組織SOD 活性、MDA 含量及TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 模型組與正常對照組比較，SOD 活性明顯降低（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平增加（P＜0.05）；模型+益生菌組SOD活性明顯高于模型組（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β 含量低于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；正常+益生菌組與正常組比較，SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量差異無統計學意義（P＞0.05，表3）。

表3 各實驗組大鼠SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 結果比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA，TNF-α，IL-6 and IL-1β in rats of each group ±s

表3 各實驗組大鼠SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 結果比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA，TNF-α，IL-6 and IL-1β in rats of each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05,##P ＜0.01

組別正常對照組模型組模型+益生菌組正常+益生菌組F 值P 值n 10 10 10 10 SOD（U∕mg）121.36±8.47 72.83±5.79**88.23±8.16*##126.94±9.52##95.36＜0.001 MDA（nmol∕mg）0.84±0.09 1.89±0.27**1.65±0.18**#0.81±0.07##127.55＜0.001 TNF-α（pg∕mg）116.04±13.31 345.13±46.30**279.27±38.76**##120.37±14.87##122.71＜0.001 IL-6（pg∕mg）86.46±17.14 247.72±41.37**213.35±32.17**#85.20±19.48##88.28＜0.001 IL-1β（pg∕mg）159.24±32.69 518.30±89.63**467.62±71.14**##151.70±29.57##205.64＜0.001

2.3 各組肝組織NF-κB、TLR4 mRNA表達比較模型組NF-κB、TLR4 mRNA 表達量高于正常對照組（P＜0.05）；模型+益生菌組與模型組比較，NF-κB、TLR4 mRNA 表達量明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；正常+益生菌組NF-κB、TLR4 mRNA 表達與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05，表4）。

表4 各實驗組大鼠NF-κB 和TLR4 mRNA 表達的比較Tab.4 Comparison of NF-κB and TLR4 mRNA in rats of each group ±s

表4 各實驗組大鼠NF-κB 和TLR4 mRNA 表達的比較Tab.4 Comparison of NF-κB and TLR4 mRNA in rats of each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別正常對照組模型組模型＋益生菌組正常＋益生菌組F 值P 值n 10 10 10 10 NF-κB 0.97±0.07 2.79±0.81**2.19±0.54**#0.90±0.07##33.26＜0.001 TLR4 1.53±0.39 4.01±0.79**3.15±0.53**#1.50±0.24##50.19＜0.001

2.4 各組肝組織NF-κB、TLR4 蛋白表達比較 與mRNA 表達水平一致，模型組NF-κB、TLR4 蛋白表達量高于正常對照組（P＜0.05）；模型+益生菌組NF-κB、TLR4 蛋白表達量低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；正常對照組與正常+益生菌組比較，NF-κB、TLR4 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05，圖1 及表5）。

圖1 Western blot 檢測各實驗組大鼠NF-κB、TLR4 蛋白表達Fig.1 The protein expression of NF-κB and TLR4 in rats of each group by Western blot

表5 各實驗組大鼠NF-κB 和TLR4 蛋白表達的比較Tab.5 Comparison of NF-κB and TLR4 protein in rats of each group ±s

表5 各實驗組大鼠NF-κB 和TLR4 蛋白表達的比較Tab.5 Comparison of NF-κB and TLR4 protein in rats of each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別正常對照組模型組模型＋益生菌組正常＋益生菌組F 值P 值n 10 10 10 10 NF-κB 0.56±0.06 1.33±0.52**1.01±0.39**#0.49±0.06##19.35＜0.001 TLR4 0.29±0.05 0.69±0.15**0.49±0.14**#0.33±0.06##16.73＜0.001

3 討論

近年來，隨著對腸-肝軸的不斷深入研究發現，作為腸道的重要組成的腸道菌群在誘導和促進肝內膽汁淤積性肝病發生和發展過程中發揮了重要的作用［2］。ANIT 誘導大鼠產生生化和病理改變與人肝內膽汁淤積性肝病相似，已被廣泛應用于肝內膽汁淤積動物模型的建立［3］。因此，本實驗應用這一模型進行研究。

人類腸道菌群是一個動態的、復雜的生態系統，在種類和數量上保持相對穩定、制約與平衡［4］。膽汁酸可影響腸道細菌增長，調節腸道菌群種類、數量，具有清潔功能和直接抑菌作用［5］。肝內膽汁淤積時，膽汁分泌、排泄異常，進入腸道的膽汁酸減少，腸道菌群的種類、數量改變，腸道黏膜機械、化學、生物及免疫屏障均被損害，腸道細菌及代謝產物如內毒素等通過“腸-肝”軸，導致一系列炎性因子的產生，進一步誘發和加重肝臟損傷［6-7］。益生菌是指對腸道內菌群平衡有益的活的微生態制劑，可分為多聯活菌制劑和單菌制劑。益生菌可以恢復腸道微生態平衡，修復腸道黏膜屏障，提高腸道定植抗力，抑制潛在致病菌過度增長，調節全身免疫功能等達到對肝臟的保護和治療作用［8］。2015年耶魯∕哈佛研討會“益生菌的應用共識意見”首次增加了益生菌在肝臟疾病中的應用，包括兒童非酒精性脂肪肝、肝性腦病和酒精性脂肪肝等［1］。本研究選用的復方嗜酸乳桿菌片為臨床常用益生菌，主要包括枯草桿菌、糞鏈球菌、日本株嗜酸乳桿菌、中國株嗜酸乳桿菌。研究發現，給予益生菌干預后，膽汁淤積大鼠血清TBiL、DBiL、TBA、ALT 和AST 水平明顯降低，與黃方等［9］研究結論一致，說明益生菌可減輕膽汁淤積性肝病的肝臟損傷，改善膽汁淤積癥狀，促進肝功能恢復。

腸道菌群失衡、腸道細菌和內毒素易位是膽汁淤積導致內毒素血癥和多器官功能衰竭的病理過程。內毒素血癥對肝臟的損傷是由一系列的氧化應激與炎癥反應所造成［10］。SOD 和MDA 是機體最常見的兩類氧化應激指標，SOD 是機體內重要的抗氧化酶，主要作用為清除體內多余的自由基，防止自由基發生脂質過氧化，其活力的高低代表機體清除氧自由基的能力；MDA 是過氧化反應的產物，高低可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度［11］。本研究結果顯示，與正常對照組相比，模型組MDA 含量升高，SOD 降低；給予益生菌干預后不僅可顯著增強SOD 活性，并且明顯降低肝臟MDA含量。提示ANIT 誘導的膽汁淤積性肝病與ANIT誘導產生的氧自由基引起的脂質過氧化損傷有關，而益生菌可減輕內毒素血癥，抑制氧化應激反應，最終起到改善膽汁淤積的作用。

TLR4 屬于細胞表面信號轉導跨膜受體，負責先天性免疫和炎癥反應，廣泛表達于多種肝臟細胞如肝細胞、肝枯否細胞、肝星狀細胞及肝樹突狀細胞等，參與介導肝臟炎癥或免疫調節等復雜免疫反應，在肝臟疾病的發生發展過程中發揮重要作用［12-13］。TLR4 是激活脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，也稱為內毒素）信號轉導的受體，LPS 通過與TLR4 結合激活細胞內信號通路、釋放各種炎癥因子等引起肝損傷［14］。NF-κB 是細胞內重要的核轉錄因子，通過調控下游多種基因的表達參與細胞的生長發育、炎癥反應、免疫調節和細胞凋亡等過程。NF-κB 信號通路受多種上游信號分子刺激而激活，TLR4 就是其中之一。TLR4 誘導NF-κB 激活轉移至胞核后可促進IL-6、IL-8、IL-12、IL-1β 及TNF-α 等細胞因子釋放，這些炎癥因子表達過量又可正反饋作用于NF-κB，繼而加重炎癥反應、加重肝組織的損傷［15-16］。LI 等［17］研究發現TLR4∕NF-κB 信號通路與非酒精性脂肪肝發病及進展密切相關。本研究發現，益生菌能明顯抑制膽汁淤積大鼠TLR4、NF-κB 表達，降低TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平。提示益生菌可能通過糾正腸道菌群紊亂，減輕腸道通透性及內毒素血癥，下調TLR4 表達，抑制NF-κB 激活，抑制TLR4∕NF-κB 信號通路，進而下調TNF-α、IL-1β 及IL-6 的釋放，減輕肝臟炎性反應，最終發揮保護肝臟及促進肝臟功能的恢復的作用。益生菌處理的正常大鼠肝功能各指標正常，提示在此治療劑量下，未發現益生菌有肝損傷的不良反應；TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β 表達與正常對照組比較差異無統計學意義，進一步證明在健康肝臟中TLR 的表達水平較低，沒有TLR4∕NF-κB 信號通路的激活，從而維持機體對內毒素的不敏感性，這與既往報道［18］一致。

綜上所述，TLR4∕NF-κB 通路是肝臟組織炎癥反應的關鍵通路，益生菌可通過抑制TLR4∕NF-κB信號通路的活化，抑制肝臟炎癥瀑布級聯反應的啟動及氧化應激反應，從而發揮對肝內膽汁淤積性肝病的治療作用，具有良好的安全性和耐受性。但對于益生菌作用于TLR4∕NF-κB 通路的上游調控機制，尚有待于進一步研究。