cMyc抑制劑10058-F4誘導白血病THP1細胞凋亡和DNA損傷的機制

魏宇靖 潘婕 柯波 符環 萬才水 丁偉榮 程洪波

1江西省人民醫院血液內科（南昌330006）；2江西省血液腫瘤細胞生物學重點實驗室（南昌330006）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種常見的惡性血液腫瘤，主要表現為骨髓中髓系原始細胞惡性增生，導致骨破壞、骨髓造血衰竭和多個器官組織損傷。AML 好發于老年人，中位發病年齡為68 歲［1］，60 歲以上的老年患者預后較差，只有2.4%的患者能達到診斷后10年的無病存活。AML 復發和耐藥仍不可避免，具有高度的異質性，在過去的許多年里，隨著新藥的問世以及新型治療策略的發展，AML 的治療也取得一定的進步。盡管異基因造血干細胞移植認為是至今AML 治愈的唯一途徑，但是仍可能出現復發。因此，新的治療策略和新藥的研發仍亟待問世。

原癌基因Myc（cMyc）是一種轉錄激活因子，其與MAX 轉錄因子結合形成異二聚體，與E-box DNA 結合區域結合調控靶基因的轉錄翻譯，參與細胞周期、凋亡和細胞轉化等細胞進程［2-3］。大約20%的腫瘤與cMyc 的表達相關，其在惡性血液腫瘤的發生發展過程中有著重要的作用［3］。10058-F4 是一種靶向cMyc 蛋白的小分子抑制劑，可以抑制腫瘤細胞增殖并促進細胞凋亡，體外實驗證實對多種腫瘤細胞具有增殖抑制及促凋亡作用。有研究結果表示，cMyc 蛋白的上調表達通過調節K562 細胞上的NKG2D 配體的表達，促進逃避NK細胞介導的免疫應答［4］。cMyc 通過結合PD-L1 基因啟動子，調控腫瘤細胞中細胞程序性死亡-配體1（PD-L1）基因的表達，并且兩者在食道鱗狀細胞癌中的表達水平具有相關性［5］。有文獻報道cMyc抑制劑10058-F4 可以通過調控多種信號途徑促進白血病細胞凋亡，但仍未完全闡明其作用機制。因此，本研究通過cMyc 抑制劑10058-F4 處理急性單核細胞白血病THP1 細胞，熒光探針染色分析細胞凋亡和線粒體膜電位變化，Western blot 檢測與DNA 損傷和細胞凋亡相關蛋白表達，探討其對細胞凋亡的誘導作用和分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人急性單核細胞白血病THP1 細胞株購于南京凱基公司，cMyc 抑制劑10058-F4 購于上海源葉公司；胎牛血清購于Gibco 公司，RPMI-1640 培養基、青鏈霉素購于北京索萊寶公司；細胞培養板和培養瓶購于無錫耐思特公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞計數試劑盒購于上海AbMole公司；JC-1 熒光染料購于上海翊圣公司；細胞周期檢測試劑盒購于南京凱基公司；Calcein∕PI 檢測試劑盒購于上海碧云天公司。兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Bcl2 相關X 蛋白（BAX）、成熟型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、磷酸化毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白（pATM）和磷酸化組蛋白H2A.X（γH2AX）一抗和羊抗兔標記辣根過氧化物酶（HRP）二抗購于美國abcam 公司。Western 一抗稀釋液和封閉液購于上海碧云天公司；超敏ECL 化學發光試劑盒購于上海碧云天公司；倒置熒光顯微鏡購于德國徠卡公司；酶標儀購于美國賽默飛公司；CO2細胞恒溫培養箱購于日本三洋公司；垂直電泳槽和半干轉膜儀購于美國BioRad 公司；流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞系及細胞培養 人急性單核細胞白血病THP1 細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液懸浮培養，用新鮮培養液懸浮細胞后鋪種于96孔或者12 孔細胞培養板。

1.2.2 細胞生長抑制檢測 THP1 細胞用培養液懸浮并計數，將細胞密度調整至1 × 106細胞∕mL，加入終濃度為1、5、10、50、100 μmol∕L 的cMyc 抑制劑10058-F4，對照組加入等體積二甲基亞砜（DMSO），取100 μL 鋪種于96 孔板，繼續培養12 h和24 h 后每孔加入CCK-8 試劑，孵育2 h 后檢測450 nm 處的吸光度（OD450），比較不同濃度cMyc抑制劑10058-F4 對THP1 細胞的抑制率，每組設置3 個復孔。

1.2.3 Calcein/PI 熒光染色分析細胞凋亡 按照上述方法懸浮細胞，分別加入不同濃度的cMyc 抑制劑10058-F4（1、5、10、50、100 μmol∕L），并取2 mL接種于12 孔細胞培養板中，繼續培養24 h 后，收集細胞并用PBS 緩沖液清洗，加入Calcein∕PI 檢測工作液，37 ℃避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 細胞周期檢測 按照上述方法懸浮并鋪種細胞，繼續培養24 h 后，收集細胞并用PBS 緩沖液清洗，緩慢加入預冷的70%乙醇后固定細胞24 h，用PBS 緩沖液清洗后按照說明書要求加入RNase（50 μg∕mL），37 ℃水浴30 min，PBS 清洗后400 μL PI（50 μg∕mL），4 ℃避光染色30 min，流式細胞儀上機檢測。

1.2.5 JC-1 細胞線粒體膜電位檢測 按照上述方法懸浮并鋪種細胞，繼續培養24 h 后，收集并清洗細胞。并用0.5 mL 新鮮培養基懸浮細胞，加入0.5 mL JC-1 染色工作液，混勻后37 ℃避光孵育20 min，用JC-1 染色緩沖液清洗細胞2 次，用適量緩沖液重懸細胞，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Western blot檢測 按照上述方法懸浮并鋪種細胞，繼續培養24 h 后，收集細胞并加入RAPI細胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解2 h 后用BCA 法定量樣品的蛋白濃度。每孔道取20 μg 的樣品上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，于封閉液中室溫封閉2 h；4 ℃一抗孵育過夜，PBST 漂洗4 次，每次7 min；用二抗室溫孵育2 h，PBST 漂洗4 次；用配置好的化學發光反應液孵育PVDF 膜，化學發光成像系統中顯影拍照，用Image J 圖像分析軟件分析目的蛋白條帶與內參條帶光密度比值，得出目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 數據采用GraphPad Prism 7 軟件進行統計分析，實驗結果以均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間的差異比較采用非配對t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 cMyc抑制劑10058-F4抑制THP1細胞增殖 采用CCK-8 方法對THP1 細胞增殖進行檢測，檢測結果顯示不同濃度cMyc 抑制劑10058-F4（1、5、10、50、100 μmol∕L）處理THP1 細胞12 h 和24 h 后，均對THP1 細胞增殖產生明顯的抑制作用，該抑制作用隨著cMyc 抑制劑10058-F4 濃度增加抑制效應也隨之增強，cMyc 抑制劑10058-F4 處理THP1 細胞24 h 后的抑制作用明顯高于12 h 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 cMyc 抑制劑10058-F4 不同濃度和作用時間對THP1細胞生長抑制率的影響Fig.1 The effects of cMyc inhibitor 10058-F4 with different concentrations and time on growth inhibition rate of THP1 cells

2.2 cMyc抑制劑10058-F4誘導THP1細胞凋亡 Calcein∕PI 熒光染色結果顯示，cMyc 抑制劑10058-F4 處理處理后，PI 陽性細胞隨著藥物濃度的增高而增加。Calcein 染色代表細胞活力，染色結果顯示低濃度（1 μmol∕L 和5 μmol∕L）組中Calcein 熒光強度與對照組差異無統計學意義，高濃度組（10、50、100 μmol∕L）中Calcein 熒光強度明顯減弱低。結果提示cMyc 抑制劑10058-F4 可降低細胞活力，誘導THP1 細胞的凋亡，見圖2。

圖2 cMyc 抑制劑10058-F4 誘導THP1 細胞凋亡Fig.2 The cMyc inhibitor 10058-F4 induces apoptosis of THP1 cells

2.3 cMyc 抑制劑10058-F4 誘導THP1 細胞中線粒體膜電位下降 THP1 細胞經不同濃度cMyc 抑制劑10058-F4 處理24 h 后，經過線粒體膜電位熒光探針（JC-1）的加載，通過熒光顯微鏡觀察熒光的變化，反映細胞線粒體膜電位的變化，結果顯示不同濃度的cMyc 抑制劑10058-F4 處理THP1 細胞后紅素熒光逐漸減弱，綠色熒光增強，平均熒光強度（MFI）比值逐漸降低，提示線粒體膜電位出現下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。結果表明cMyc 抑制劑10058-F4 誘導THP1 細胞凋亡可能是通過降低線粒體膜電位所介導。

圖3 cMyc 抑制劑10058-F4 誘導THP1 細胞線粒體膜電位下降Fig.3 The cMyc inhibitor 10058-F4 induced a decrease in mitochondrial membrane potential in THP1 cells

2.4 cMyc 抑制 劑10058-F4 誘導THP1 細胞G2/M細胞周期阻滯 THP1 細胞經不同濃度cMyc 抑制劑10058-F4 處理24 h 后，流式細胞儀分析細胞周期。結果顯示不同濃度的cMyc 抑制劑10058-F4處理THP1 細胞后，S 期細胞比例均明顯高于對照組，G1 期細胞細胞比例低于對照組，G2∕M 期細胞比例隨著藥物濃度逐漸上升，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），提示10058-F4對THP1 細胞可能具有DNA 損傷誘導作用，見圖4。

2.5 cMyc 抑制劑F410058 誘導THP1 細胞凋亡和DNA 損傷相關蛋白的表達 THP1 細胞經cMyc 抑制劑10058-F4 處理24 h 后，Western blot 檢測細胞中相關蛋白表達水平。結果顯示不同濃度的cMyc抑制劑10058-F4 處理后，促凋亡蛋白Bax 和Cleaved-Caspase-3 的表達水平明顯高于對照組，參與DNA損傷應答蛋白γH2AX 和pATM 的表達水平也明顯高于對照組，并隨著藥物濃度逐漸上調，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），如圖5。結果提示cMyc 抑制劑10058-F4 可能誘導THP1 細胞DNA 損傷，激活P53 相關信號途徑促進細胞凋亡。

圖5 cMyc 抑制劑10058-F4 對THP1 細胞凋亡和DNA 損傷相關蛋白表達的影響Fig.5 Effects of the cMyc inhibitor 10058-F4 on the protein expression associated with apoptosis and DNA damage in THP1 cells

3 討論

AML 是一種目前尚未能治愈的惡性血液腫瘤，AML 的顯著特征為疾病的克隆性進展。雖然化療和造血干細胞移植為代表的治療策略能提高緩解率，但仍會出現復發以及藥物耐受，特別是老年患者由于存在基礎疾病，治療反應性差，需要進行個體化治療［6］。cMyc 作為原癌基因，在多種腫瘤和血液腫瘤中高表達或者存在突變，其作為轉錄因子與Max 形成異二聚體，并與靶基因啟動子區的特異的E-box DNA 序列結合［7］。小分子化合物可以通過抑制cMyc-MAX 復合物的形成，降低cMyc 的轉錄活性并導致其靶基因表達受阻，從而影響細胞周期和細胞凋亡［8］。Myc 可以促進壁龕中的造血干細胞進入增殖祖細胞狀態，cMyc 蛋白的表達將介導細胞周期快速進入G1 期，其后表達下調，從而參與細胞周期調控［9］。cMyc 受核因子κB（NF-κB）信號途徑調控，IκB 激酶（IKK）復合物中IKKα 和IKKβ 與cMyc 結合，并通過催化其S67 和S71 磷酸化位點增強其穩定性，轉錄翻譯抗凋亡蛋白發揮其抗凋亡作用［10］。cMyc 作為Flt3-ITD 信號的下游靶標，Flt3-ITD 通過Wnt 信號途徑調控cMyc，而且Flt3-ITD 還可以抑制Myc 拮抗物Mxi-1 從而增強Myc 活性，高三尖杉酯堿聯合奎扎替尼可以通過抑制FLT3-AKT-cMyc 信號途徑增強FLT3-ITD 急性髓系白血病細胞體外治療效果［11-12］。多肽類抑制劑OmoMYC 可以抑制三種MYC 蛋白與啟動子的結合能力，發揮抗腫瘤作用明顯且副作用少，并且以及進入臨床試驗階段。APTO-253 抑制劑通過抑制MYC 基因的表達水平，用于復發∕難治性AML 和骨髓異常綜合征的治療，也進入了I 期臨床試驗階段［13-14］。

THP1 細胞來源于急性單核細胞白血病患者，其屬于AML 中一種亞型，攜帶CSNK2A1-DDX39B融合基因［15］。本研究應用CCK-8 和細胞凋亡實驗，分析cMyc 抑制劑10058-F4 對THP1 細胞的生長抑制及細胞凋亡的誘導作用。實驗結果顯示，1 ～100 μmol∕L 濃度的cMyc 抑制劑F410058 呈濃度依賴性地抑制THP1 細胞增殖；熒光探針染色實驗結果顯示1 ～100 μmol∕L 的cMyc 抑制劑10058-F4處理組細胞中Calcein 熒光強度逐漸降低，活性細胞數也明顯降低，PI 陽性細胞數比例明顯高于對照組，提示cMyc 抑制劑10058-F4 對THP1 細胞具有明顯的細胞毒性和細胞凋亡誘導作用。cMyc 抑制劑10058-F4 可以誘導細胞凋亡，但是其作用機制仍未闡明，本研究通過JC-1 熒光探針加載細胞，熒光顯微鏡分析THP1 細胞線粒體膜電位水平變化，實驗結果顯示cMyc 抑制劑10058-F4 處理后紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強，提示線粒體膜電位隨著藥物濃度增加而逐漸下降。cMyc 抑制劑10058-F4 可以誘導卵巢癌細胞中FOXO 家族基因mRNA 水平的表達，從而上調下游與細胞凋亡相關蛋白的表達，例如PUMA，Bim，和FasL 等［16］。本研究的Western blot 實驗結果也顯示BAX 的表達水平隨著藥物濃度的增加而增強，并且細胞凋亡執行蛋白Cleaved-Caspase3 的表達水平也是表達逐漸增強。

經10058-F4 處理后的THP1 細胞經過流式細胞儀分析細胞周期，結果顯示處理后出現G2 期細胞比例隨著藥物濃度逐漸升高，提示10058-F4 可誘導THP1 細胞的G2∕M 細胞周期阻滯，并可能具有DNA 損傷誘導作用。也有研究［17］表明，下調骨肉瘤細胞cMyc 的表達可以抑制細胞增殖，并通過cMyc∕p21∕CDC2 信 號 途 徑 誘 導G2∕M 細 胞 周 期阻滯，增強細胞對化療的敏感性。還有研究顯示CircECE1 與cMyc 相互作用以抑制E3 泛素連接酶斑點型鋅指結構蛋白（speckle-type POZ）介導的cMyc 泛素化和降解，從而抑制硫氧還蛋白結合蛋白（TXNIP）轉錄，并激活Warburg 效應，參與糖代謝調節［18］。本研究通過Western blot 實驗分析發現10058-F4 處理可以上調ATM 和H2AX 蛋白磷酸化水平，提示10058-F4 可誘導DNA 損傷和相關蛋白的活化。有研究［19］指出，cMyc 過表達將促進S 期時象細胞啟動DNA 復制過程，并加劇DNA 基因組的不穩定性，促進H2AX 的磷酸化水平，可能導致腫瘤的發生。Myc 可以通過產生活性氧簇以及異常的DNA 復制誘導DNA 損傷，聯合抑制PI3K 相關的DNA 損傷應答激酶和mTORC1 可誘導Myc 驅動的B 細胞淋巴瘤細胞凋亡［20］。但是至今未見到關于10058-F4 誘導DNA 損傷應答及作用機制的文獻報道。

綜上所述，cMyc 抑制劑F410058 對單核細胞白血病THP1 細胞的增殖具有抑制作用，并誘導細胞凋亡，可能是通過誘導線粒體凋亡途徑所介導。同時，cMyc 抑制劑F410058 還具有誘導DNA損傷的作用，也是其誘導細胞凋亡的主要機制之一。cMyc 抑制劑F410058 的抗白血病作用機制的研究為AML 的臨床治療提供理論基礎，可能成為AML 患者潛在的治療選擇。