6-羥基多巴胺單側帕金森病模型大鼠丘腦腹內側核的放電活動

潘琪 張旺明 羅非 徐如祥

1海南醫學院第一附屬醫院神經外科（海口570102）；2南方醫科大學珠江醫院神經外科（廣州510280）；3中國科學院心理研究所（北京100101）；4四川省人民醫院神經外科（成都610072）

帕金森病是一種多見于中老年人的神經退行性疾病，以靜止性震顫、運動緩慢、肌強直和姿勢步態障礙為癥狀特征，以黑質多巴胺能神經元變性和紋狀體內多巴胺嚴重減少為病理學特點［1-2］。帕金森病的病理變化引起大腦皮層［3］、基底神經節［4］、丘腦［5］和腦干神經核團［6］等數個區域的神經電活動出現改變，包括：神經元放電頻率改變、神經元放電模式改變和場電位改變等，最終造成了帕金森病的運動癥狀［7］。其中，帕金森病情況下，有關丘腦內神經核團的神經元放電活動的研究相對較少，且研究結果也并不完全一致［8］。丘腦腹內側核（ventromedial thalamic nucleus，VM）是運動丘腦的關鍵核團之一，參與構成了大腦皮層-基底神經節-丘腦-大腦皮層的運動環路［9］。ROLLAND等［10］發現帕金森病大鼠模型丘腦腹內側核的代謝活動明顯減低，這可能反映了丘腦腹內側核電活動的降低。但帕金森病條件下丘腦腹內側核的放電活動改變仍未完全明確。本研究應用神經元單位放電在體多通道同步記錄方法研究6-羥基多巴胺（6-OHDA）單側帕金森病模型大鼠丘腦腹內側核的電活動變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠12 只（購自軍事醫學科學院實驗動物中心），體質量250～300 g，自由飲食、飲水，室溫維持在（22 ± 2）℃。所有實驗操作符合南方醫科大學動物倫理學要求。

1.2 試劑與儀器 6-OHDA（H4381）、阿撲嗎啡（apomorphine，APO）（D004）、地昔帕明（D3900）、L-抗壞血酸（A0278）、小鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗 體（T1299）、多 聚 甲 醛（158127）、甲酚紫（114375）購自Sigma-Aldrich 公司。免疫組織化學檢測試劑盒（SP-9002）和DAB試劑盒（ZLI-9032）購自北京中杉金橋公司。大鼠腦立體定位儀（51603 型，stoelting 公司），記錄電極（2*4 型，美國東樂公司），神經元單位放電在體多通道同步記錄系統（cerebus128 通道系統，美國Blackrock 公司），電生理數據分析軟件（NeuroExplorer，美國plexon 公司），電損毀儀（53500 型，Ugo Basile 公司）。

1.3 實驗流程 12 只SD 大鼠喂養7 d 以適應新環境；完成大鼠腦部埋置不銹鋼管和記錄電極的手術；大鼠手術后恢復1 周，然后完成建立帕金森病模型前的在體電生理記錄實驗；進行大鼠帕金森病模型的制備和鑒定；對成功大鼠模型進行在體電生理記錄實驗；電生理記錄實驗完成后，處死實驗動物，取腦組織做病理檢查。

1.4 大鼠腦部埋置不銹鋼管和記錄電極手術 腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg∕kg）麻醉大鼠。將大鼠固定在腦立體定位儀上。參照PAXINOS 等［11］編寫的大鼠腦立體定位圖譜，右側內側前腦束上方2 mm 處的坐標是前囟后2.0 mm、右側2.0 mm和腹側6.1 mm，此坐標是用于后期注射6-OHDA的不銹鋼管置入端的坐標；雙側丘腦腹內側核坐標是前囟后2.9 mm，左側或右側1.4 mm 和大腦皮層下6.9 mm。備皮、常規消毒，磨開坐標點相應區域的顱骨，使用腦立體定位儀將不銹鋼管置入端和記錄電極尖端埋置于相應坐標處。再用牙科水泥將不銹鋼管和記錄電極固定在大鼠顱骨表面。動物手術后恢復7 d，然后進行在體電生理記錄實驗。

1.5 神經元單位放電在體多通道同步記錄 把大鼠放進大小為0.4 m × 0.4 m × 0.3 m 的箱中，再把記錄電極連接信號采集芯片，啟動神經元單位放電在體多通道同步記錄系統，采集動作電位。應用窗篩法篩選單個神經元放電。對各通道記錄到的神經元進行篩選后，記錄每個動作電位的時間點。同時啟動視頻系統，對動物的活動進行錄像。使用Neuroexplorer 電生理數據分析軟件離線分析大鼠無肉眼可見活動時的電生理數據。對神經元平均放電頻率和放電模式進行了考察。其中，將神經元放電模式分為爆發放電和非爆發放電。

1.6 建立帕金森病大鼠模型 大鼠腹腔注射地昔帕明（15 mg∕kg）。0.5 h 后用微量注射器將12 μg∕4 μL 6-OHDA（用含有0.2 %L-抗壞血酸的生理鹽水配置）通過不銹鋼管注入右側內側前腦束內。6-OHDA 注入2 周后，采用APO 誘導旋轉測試評價單側帕金森病大鼠模型建立情況。對大鼠予皮下注射APO（0.25 mg∕kg）。然后，將大鼠放入半球形容器內。給藥10 min 后記錄大鼠向毀損對側旋轉的次數，共記錄0.5 h。成功模型的標準：大鼠向毀損對側旋轉的平均圈數大于7 圈∕min［12-13］。

1.7 標記記錄電極尖端的位置 用8%水合氯醛（腹腔注射，400 mg∕kg）麻醉動物。向記錄電極施加20 μA 的陽極直流電，時長20 s。將大鼠固定在實驗板上。用37 ℃生理鹽水（300 mL∕只）從左心室快速灌注，再用4%多聚甲醛（含有5%亞鐵氰化鉀，400 mL∕只）灌注。取出鼠腦，并用后者固定6 h。

1.8 黑質TH免疫組織化學染色和神經元計數 對鼠腦進行冰凍切片，切片厚度為30 μm。按免疫組織化學檢測試劑盒說明書進行大鼠中腦組織TH 免疫組織化學染色。小鼠抗TH 抗體的稀釋比例是1∶1 000。神經元數目計算方法：取前囟后4.8、5.2、5.6 mm 的切片各1 張，在顯微鏡下對左右兩側黑質的TH 陽性神經元進行計數，并將3 張切片左右側神經元數目分別相加，得出每只大鼠單側黑質TH 陽性神經元數目。黑質內神經元殘存率以右側黑質與左側黑質的TH 陽性神經元數目的百分比表示。

1.9 丘腦腹內側核的甲酚紫染色 對鼠腦進行冰凍切片，切片厚度為40 μm。用0.5 %甲酚紫染色0.5 h。用雙蒸水分化5 min。用梯度酒精脫水；用二甲苯透明切片；最后進封片。

1.10 統計學方法 記錄電極尖端在丘腦腹內核內的成功大鼠模型的數據用于統計學分析。數據采用SPSS 13.0 軟件分析。結果采用均數±標準差表示。神經元平均放電頻率的比較采取重復測量方差分析。模型建立前和模型建立后的神經元放電模式數據采取配對χ2檢驗進行比較。雙側丘腦腹內側核的神經元放電模式數據采取成組χ2檢驗進行比較。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 帕金森病大鼠模型的建立 本研究從12 只大鼠中獲得9 只成功的帕金森病模型大鼠，模型建立的成功率約為75%。模型建立2 周后，成功的模型大鼠皮下注射阿撲嗎啡（0.25 mg∕kg）后出現向毀損對側快速旋轉的行為。模型大鼠的毀損側黑質的TH 陽性神經元大量喪失（圖1），神經元殘存率為2.1%～13.5%。

圖1 黑質TH 免疫組織化學染色Fig.1 TH immunohistochemical staining of substantia nigra

2.2 記錄電極尖端的解剖位置 大鼠腦立體定位圖譜判斷記錄電極尖端是否在丘腦腹內側核內（圖2）。在模型大鼠中，6 個記錄電極尖端在左側丘腦腹內核內，7 個記錄電極尖端在右側丘腦腹內側核內。全部記錄電極尖端的位置見圖3。

圖2 丘腦腹內側核的甲酚紫染色Fig.2 Cresol purple staining of VM

圖3 記錄電極尖端的位置。Fig.3 Thelocations of electrode tips

2.3 丘腦腹內側核神經元平均放電頻率 本研究在9 只帕金森病模型大鼠的左側丘腦腹內側核內共有46 個神經元被記錄到，在右側丘腦腹內側核內共有54 個神經元被記錄到。雙側丘腦腹內側核在模型建立前和模型建立后的神經元平均放電頻率如圖4 所示。模型建立前的左側和右側丘腦腹內側核神經元的平均放電頻率分別是（14.516 9±0.575 0）Hz 和（15.733 7±0.5360 8）Hz，兩者差異無統計學意義（t= 1.547，P= 0.125）。模型建立后的左側和右側丘腦腹內側核神經元的平均放電頻率分別是（15.528 7 ± 0.572 69）Hz 和（5.698 1 ±0.279 1）Hz，兩者差異有統計學意義（t= 15.431，P＜0.001）。和模型建立前比較，模型建立后的右側丘腦腹內側核神經元的平均放電頻率顯著下降（F=306.701，P＜0.001）。和模型建立前比較，模型建立后的左側丘腦腹內側核神經元的平均放電頻率無顯著變化（F=1.331，P=0.255）。

圖4 丘腦腹內側核神經元平均放電頻率Fig.4 The mean firing rate of neurons in VM

2.4 丘腦腹內側核神經元放電模式 左側丘腦腹內側核內不同放電模式的神經元數量見表1。模型建立前和模型建立后的神經元爆發放電率分別是21.7%和17.4%。與模型建立前相比，模型建立后的左側丘腦腹內側核內爆發放電神經元的比例無顯著變化（P= 0.688）。右側丘腦腹內側核內不同放電模式的神經元數量見表2。模型建立前和模型建立后的神經元爆發放電率分別是14.8%和44.4%。與模型建立前相比，模型建立后的右側丘腦腹內側核爆發放電神經元比例明顯增加（P=0.001）。模型建立前，與左側丘腦腹內側核相比較，右側丘腦腹內側核內爆發放電神經元比例差異無統計學意義（χ2= 0.807，P=0.369）。模型建立后，與左側丘腦腹內側核相比較，右側丘腦腹內側核內爆發放電神經元比例明顯增加（χ2=8.355，P=0.004）。

表1 左側丘腦腹內側核內不同放電模式神經元的數量Tab.1 The number of neurons with different discharge patterns in leftVM

表2 右側丘腦腹內側核內不同放電模式神經元的數量Tab.2 The number of neurons with different discharge patterns in right VM

3 討論

本研究發現6-OHDA 單側帕金森病大鼠模型丘腦腹內側核神經元的平均放電頻率顯著下降，多數神經元的放電模式發生改變，爆發放電神經元的比例增加。

本研究利用神經元單位放電在體多通道記錄方法，發現6-OHDA 單側帕金森病大鼠模型丘腦腹內側核神經元的放電頻率減小，該結果和經典的“放電頻率”模型相符合［14］。該模型推測帕金森病患者黑質-紋狀體多巴胺能神經通路變性通過直接通路和間接通路引起作為基底神經節輸出核團的蒼白球內側部和黑質網狀部的神經活動增強。而后兩者向丘腦腹內側核發出大量利用抑制性神經遞質GABA 的神經纖維投射。因此，在帕金森病情況下，蒼白球內側部和黑質網狀部的神經活動出現增強，丘腦腹內側核的神經活動被抑制，從而表現出神經元放電頻率的減小。早期研究發現帕金森病大鼠模型丘腦腹內側核的代謝活動減弱［10，15］，這可能反映了丘腦腹內側核神經元放電活動的降低。丘腦腹內側核發出大量興奮性神經纖維分布至大腦皮質的多個部位［16］，在動作啟動、動作選擇和運動活力的神經編碼中起重要作用［17］。丘腦腹內側核神經活動的降低，對大腦皮質的活化下降，最后引起帕金森病患者的隨意動作減少、動作遲緩等表現。有研究報道高頻率電刺激大鼠黑質網狀部可以增加丘腦腹內側核的神經元放電頻率，且大鼠的運動障礙表現得到改善［18］；另外，有研究者發現高頻電刺激帕金森病模型大鼠的束旁核，丘腦腹內側核神經元的放電頻率顯著升高［19］。綜合上述結果，可以推論丘腦腹內側核神經元放電活動的下降參與了帕金森病運動障礙癥狀的發生機制，而提高丘腦腹內側核神經元放電活動可能改善帕金森病運動障礙癥狀。

本研究同時發現帕金森病模型大鼠丘腦腹內側核內爆發放電神經元的比例增加。該結果和使用其他模型進行研究的發現相類似［20-21］。很多研究發現，作為基底神經節輸出核團的黑質網狀部和蒼白球內側部神經元的放電模式在帕金森病條件下出現了顯著變化，更多的神經元轉變成爆發式放電［22］。這種電活動的變化可能通過黑質網狀部和蒼白球內側部向丘腦腹內側核發出的神經纖維傳導至后者。目前，帕金森病時這種神經元放電模式的變化和運動癥狀的關系尚未闡明清楚。有研究發現，在帕金森病模型中，丘腦腹內側核出現同步化的神經元活動，而這種改變促進了整個基底神經核-丘腦-皮層網絡的高β 振蕩的出現，而后者被認為是導致帕金森病運動癥狀的關鍵神經電活動改變［23］。

6-OHDA 單側帕金森病大鼠模型是一種常用的帕金森病動物模型，能夠部分模擬出帕金森病的病理改變和臨床癥狀［24］。其中，將較大劑量的6-OHDA 注射入大鼠一側的內側前腦束能夠嚴重毀損一側黑質-紋狀體多巴胺能神經通路，導致黑質多巴胺能神經元和紋狀體多巴胺能神經纖維大量喪失，大鼠表現出明顯運動障礙行為，類似中晚期帕金森病患者的病理改變和運動癥狀。通過這種方法建立的單側帕金森病模型在帕金森病電生理研究中被廣泛應用［25］。單側帕金森病模型僅一側黑質-紋狀體多巴胺能神經通路被損毀，而另一側通路仍然完好，后者被認為是良好的內部參照物。本研究也確實發現健側丘腦腹內側核在模型建立前和模型建立后的電活動無顯著變化。有研究報道，生物的覺醒水平影響神經系統的電活動，而帕金森病能夠導致生物的覺醒水平發生變化［26］。為了排除帕金森病模型建立后，大鼠的覺醒水平的改變對神經元電活動變化的影響，本研究比較了健側和毀損側的實驗數據。為了排除一側毀損對另一側核團的電活動的影響，本研究又對模型建立前和模型建立后的數據進行了比較。同時使用這兩種分析方法，在一定程度上提高了研究結果的可信度。

綜上所述，本研究發現6-OHDA 單側帕金森病模型大鼠丘腦腹內側核神經元放電頻率下降，且爆發放電神經元比例增加，丘腦腹內側核可能在帕金森病的病理生理機制中扮演重要角色。