表沒食子兒茶素沒食子酸酯對低氧環(huán)境下肺心病大鼠呼吸衰竭的改善作用

汪洋 張輝 伍冬冬 王圓方 劉帥 馬東波 鄧翔 吳秋歌

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（鄭州450052）

肺心病是由于支氣管-肺、胸廓或肺動脈發(fā)生病變，引起肺循環(huán)阻力增加，導(dǎo)致肺動脈高壓和右心室肥大的一種疾?。?］。肺動脈高壓引起肺血管重塑是肺心病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，臨床以右心室肥厚及功能不全為主要特征，發(fā)病過程中肺部持續(xù)性、進展性氣流受限，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴重通氣功能障礙，最終引起呼吸衰竭，嚴重影響患者生命安全［2］。

茶葉系山茶科植物茶樹的干燥嫩葉或葉芽，是一種傳統(tǒng)的藥食同源的天然保健飲品。茶葉中含有咖啡堿、茶多酚、維生素類、礦物質(zhì)、氨基酸和脂多糖等物質(zhì)，其中茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉的主要生理活性成分［3］。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚具有抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化、強心、抗心律失常、抗衰老和抗菌等多種生物活性，并且揭示這些生物活性均與其抗氧化作用有關(guān)［4-5］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）為茶多酚中主要的活性成分。研究［6-7］表明，EGCG 能抑制低氧引起的肺動脈平滑肌細胞增殖，并通過KLF-4∕MFN-2∕p-Erk信號通路抑制低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓和右心室重構(gòu)，提示EGCG 對右心功能不全引起的呼吸衰竭具有改善作用。

鑒于EGCG 對肺動脈高壓形成可能的干預(yù)作用，本研究采用不同劑量的EGCG，探討其對低氧環(huán)境下肺心病大鼠呼吸衰竭的改善作用，為開發(fā)治療肺心病的藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠50 只，7 周齡，平均體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠購入后保持溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%，明暗周期12 h∕12 h 循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本動物實驗經(jīng)鄭州大學(xué)動物倫理學(xué)委員會審核批準（編號：syxk2017-221）。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 EGCG（美國Sigma公司），鹽酸納洛酮注射液（10 mL：4 mg，國藥準字：H20064788，北京凱因科技股份有限公司），大鼠白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（美國R&D 公司），G-100 血氣分析儀（深圳市西爾曼科技有限公司），SCIREQ 小動物肺功能檢測儀（北京廣源達科技發(fā)展有限公司），DYCP-31DN 電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組及干預(yù)方法 將50 只大鼠，隨機分為正常對照組、模型組、EGCG 低劑量組、EGCG高劑量組和陽性對照組，每組各10 只。除健康組外，其余4 組大鼠建立肺心病模型［5］：將大鼠置于常壓低氧艙內(nèi)，艙內(nèi)通過充入氮氣，使氧氣濃度保持在8%～11%，用無水CaCl2和堿石灰吸收艙內(nèi)水分和CO2，使CO2濃度低于3%，4 組大鼠每天置于艙內(nèi)8 h，每周6 d，共計4周。根據(jù)動物與人體等效劑量換算，模型組、EGCG 低劑量組、EGCG 高劑量組和陽性對照組大鼠分別于每天入倉前30 min 腹腔注射0.5 mL 生理鹽水、10 mg∕kg EGCG、50 mg∕kg EGCG、1.0 mg∕kg 鹽酸納洛酮注射液。正常對照組大鼠不入艙，腹腔注射生理鹽水0.5 mL∕只，每天1 次，每周6 天，共干預(yù)4 周。

1.2.2 肺功能相關(guān)指標檢測 末次干預(yù)后12 h，使用小動物肺功能檢測儀檢測各組大鼠肺功能相關(guān)指標，記錄大鼠呼吸頻率、呼氣阻力、呼氣峰流速值（peak expiratory flow，PEF）和50%肺活量時最大呼氣流量（50%forced expiratory flow，F(xiàn)EF50）。

1.2.3 動脈血氣相關(guān)指標及血清IL-8、TNF-α 水平檢測 肺功能檢測結(jié)束后，采用3%戊巴比妥鈉（40 mg∕kg）腹腔注射麻醉大鼠，股動脈采血，3 500 r∕min（離心半徑10 cm）離心10 cm，取血清，一部分血清使用全自動血氣分析儀檢測氫離子濃度（pH）、氧分壓（PaO2）、二氧化碳分壓（PaCO2）。一部分血清采用酶聯(lián)免疫分析法檢測血清中IL-8、TNF-α 水平，反應(yīng)結(jié)束后使用酶標儀在450 nm 波長讀取吸光度值，根據(jù)標準曲線計算血清中IL-8、TNF-α 水平。

1.2.4 血流動力學(xué)及右心室肥厚情況檢測 采血結(jié)束后，將大鼠仰臥固定，頸部備皮后正中部切口，分離頸部右側(cè)皮膚，游離頸外靜脈，結(jié)扎遠心端，行右心室插管術(shù)，記錄大鼠肺動脈壓力和頸總動脈壓力波形，檢測平均肺動脈壓（mean pressure of pulmonary artery，mPAP）和平均頸動脈壓（mean carotid artery pressure，mCAP）。處死大鼠，迅速開胸，取出心臟，生理鹽水沖洗干凈后，分離右心室（RV）和左心室+室間隔（LV+S），分別稱重后，計算右心指數(shù)，右心指數(shù)（%）=RV∕LV+S。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺功能相關(guān)指標水平 呼吸頻率、呼氣阻力、PEF、FEF50 水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型組、EGCG 低劑量組、EGCG 高劑量和陽性對照組呼吸頻率、PEF、FEF50 水平降低，呼氣阻力升高（P＜0.05）；與模型組比較，EGCG 低劑量組、EGCG 高劑量組和陽性對照組呼吸頻率、PEF、FEF50 水平升高，呼氣阻力降低（P＜0.05）；與EGCG 低劑量組比較，EGCG 高劑量組和陽性對照組呼吸頻率、PEF、FEF50 水平升高，呼氣阻力降低（P＜0.05）。EGCG高劑量組與陽性對照組呼吸頻率、呼氣阻力、PEF、FEF50水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺功能指標水平比較Tab.1 Comparison of lung function index levels of rats in each group ±s

表1 各組大鼠肺功能指標水平比較Tab.1 Comparison of lung function index levels of rats in each group ±s

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與EGCG 低劑量組比較，cP ＜0.05

組別正常對照組模型組EGCG低劑量組EGCG高劑量組陽性對照組F值P值呼吸頻率（次∕min）92.33±7.55 48.35±5.43a 61.25±6.91ab 79.47±7.62abc 81.59±7.97abc 50.759＜0.001呼氣阻力［cmH2O∕（L·s）］1.47±0.23 2.33±0.31a 1.79±0.18ab 1.68±0.21abc 1.53±0.12abc 26.114＜0.001 PEF（L∕s）44.32±4.17 29.03±2.96a 33.46±3.19ab 37.98±4.52abc 38.86±3.76abc 17.327＜0.001 FEF50（L∕s）43.65±5.01 26.87±2.36a 30.94±4.37ab 38.17±4.03abc 37.64±3.62abc 27.421＜0.001

2.2 動脈血氣指標水平 pH、PaO2、PaCO2水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型組、EGCG 低劑量組、EGCG 高劑量和陽性對照組pH、PaO2水平降低，PaCO2水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，EGCG 低劑量組、EGCG高劑量組和陽性對照組pH、PaO2水平升高，PaCO2水平降低（P＜0.05）；與EGCG 低劑量組比較，EGCG 高劑量組和陽性對照組pH、PaO2水平升高，PaCO2水平降低（P＜0.05）。陽性對照組pH、PaO2水平略高于EGCG 高劑量組，PaCO2水平略低于EGCG 高劑量組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠動脈血氣指標水平比較Tab.2 Comparison of arterial blood gas index levels of rats in each group ±s

表2 各組大鼠動脈血氣指標水平比較Tab.2 Comparison of arterial blood gas index levels of rats in each group ±s

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與EGCG 低劑量組比較，cP ＜0.05

組別正常對照組模型組EGCG 低劑量組EGCG 高劑量組陽性對照組F 值P 值pH 7.37±0.08 5.51±0.42a 6.09±0.59ab 6.82±0.61abc 6.85±0.69abc 14.375＜0.001 PaO2（mmHg）122.47±14.71 69.25±7.46a 83.53±11.37ab 105.74±11.33abc 106.18±12.54abc 40.355＜0.001 PaCO2（mmHg）39.51±4.26 60.25±6.53a 51.53±4.72ab 44.38±4.27abc 43.62±4.87abc 30.643＜0.001

2.3 血清IL-8、TNF-α 水平 血清IL-8、TNF-α 水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型組、EGCG 低劑量組、EGCG 高劑量和陽性對照組血清IL-8、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，EGCG 低劑量組、EGCG高劑量組和陽性對照組血清IL-8、TNF-α 水平降低（P＜0.05）；與EGCG 低劑量組比較，EGCG 高劑量組和陽性對照組血清IL-8、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。EGCG 高劑量組與陽性對照組血清IL-8 和TNF-α 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-8、TNF-α 水平比較Tab.3 Comparison of serum IL-8 and TNF-α levels of rats of various groups ±s

表3 各組大鼠血清IL-8、TNF-α 水平比較Tab.3 Comparison of serum IL-8 and TNF-α levels of rats of various groups ±s

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與EGCG 低劑量組比較，cP ＜0.05

組別正常對照組模型組EGCG 低劑量組EGCG 高劑量組陽性對照組F 值P 值IL-8（ng∕L）9.47±1.08 14.37±1.36a 13.56±1.45ab 10.19±1.24abc 10.11±1.16abc 46.687＜0.001 TNF-α（ng∕L）4.71±0.67 7.06±0.76a 6.01±0.43ab 5.22±0.49abc 5.15±0.61abc 27.965＜0.001

2.4 血流動力學(xué)及右心指數(shù) mPAP、右心指數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型組、EGCG 低劑量組、EGCG 高劑量和陽性對照組mPAP 水平、右心指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，EGCG 低劑量組、EGCG 高劑量組和陽性對照組mPAP 水平、右心指數(shù)降低（P＜0.05）；與EGCG 低劑量組比較，EGCG 高劑量組和陽性對照組mPAP 水平、右心指數(shù)降低（P＜0.05）。EGCG高劑量組與陽性對照組mPAP 水平、右心指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組mCAP 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血流動力學(xué)及右心指數(shù)比較Tab.4 Comparison of hemodynamics and right heart index of rats of various groups ±s

表4 各組大鼠血流動力學(xué)及右心指數(shù)比較Tab.4 Comparison of hemodynamics and right heart index of rats of various groups ±s

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與EGCG 低劑量組比較，cP ＜0.05

組別正常對照組模型組EGCG 低劑量組EGCG 高劑量組陽性對照組F 值P 值mPAP（mmHg）13.86±2.32 25.24±2.79a 21.83±1.95ab 17.76±2.05abc 17.49±2.17abc 38.217＜0.001 mCAP（mmHg）94.78±8.34 90.77±8.76 93.03±9.41 95.28±9.46 92.68±9.96 0.452 0.787右心指數(shù)（%）28.29±3.42 40.52±4.87a 36.27±3.75ab 32.42±3.54abc 32.34±3.76abc 17.647＜0.001

3 討論

肺心病是臨床常見病，多發(fā)于吸煙者以及老年人群，病程長，并發(fā)癥較多，易復(fù)發(fā)。在疾病發(fā)展后期，患者心肺功能逐漸衰弱，常伴有呼吸衰竭，患者可出現(xiàn)氣喘、紫紺、呼吸困難、血氧飽和度下降等癥狀，甚至發(fā)生休克，嚴重影響患者生存質(zhì)量［8］。臨床治療肺心病以保持呼吸通暢、控制感染和改善心肺衰竭為主要原則，多采用抗感染、糖皮質(zhì)激素類藥物改善癥狀，但由于此類藥物持續(xù)時間短且存在較大不良反應(yīng)，患者長期使用易產(chǎn)生藥物依賴及抗藥性［9］。目前臨床上采用的主要降低肺動脈高壓的藥物包括前列環(huán)腺類似物、前列環(huán)素受體激動劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶-5 抑制劑、可溶性鳥苷酸環(huán)化酶受體激活劑。以上藥物均會不同程度引起惡心、嘔吐、腹瀉、頭痛、水腫、低血壓、肝腎功能損傷等不良反應(yīng)。目前關(guān)于中藥方面的研究，只有七葉皂苷鈉、丹參酮等多種中藥及其有效成分在控制肺動脈高壓、改善肺部微循環(huán)、治療肺心病方面具有一定療效，可為臨床治療肺心病提供一定指導(dǎo)［10-11］。

肺心病引起肺泡組織空氣通過性受限，造成呼吸衰竭，呼吸頻率減慢，PEF 反映呼吸肌的力量及氣道有無阻塞，F(xiàn)EP50 反應(yīng)氣道功能障礙。發(fā)生呼吸衰竭時，由于缺氧和CO2潴留，引起酸堿失衡，通過動脈血氣分析可以判斷呼吸衰竭的呼吸及酸堿失衡情況，PaO2，PaCO2反應(yīng)呼吸功能，pH 反應(yīng)酸堿失衡情況［12-13］。肺心病發(fā)生過程中TNF-α的產(chǎn)生刺激呼吸道上皮表達IL-8，并可誘導(dǎo)p38 引起EGFR-MAPK-NF-κB-IL8 信號通路的激活，參與炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控［14-15］。研究表明EGFR∕MAPK 信號通路參與PM2.5 導(dǎo)致的肺毒性損傷及囊性纖維化肺病等肺損傷過程，通過調(diào)控EGFR∕MAPK 通路可減輕肺損傷炎癥反應(yīng)，改善肺功能［15］。通過檢測平均肺動脈壓、平均頸動脈壓及右心指數(shù)可評估血流動力學(xué)及右心室肥厚程度。因此，通過以上指標可客觀評價肺心病引起的呼吸衰竭的嚴重程度。

茶多酚是從茶葉中提取的組成復(fù)雜，分子量、性質(zhì)與化學(xué)結(jié)構(gòu)各異的多羥基酚類混合物，其中以兒茶素為主的黃烷醇類化合物是茶多酚的主體部分。兒茶素占茶多酚總量的60% ～80%，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）。其中EGCG 是茶葉中特有的兒茶素，含量最高，約占茶多酚制品的50%左右，它因其結(jié)構(gòu)中有6 個鄰位酚羥基而具有優(yōu)于其他兒茶素的許多特性［16］。研究［17-20］表明EGCG 具有顯著的抗氧化、抗炎、抗突變、抗輻射、抗病毒，對心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)具有良好的保護作用。EGCG 能顯著降低血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）含量，降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性水平，提高高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）的含量，改善大鼠肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)［21］。此外，祝田田等［6］研究表明，EGCG 抑制低氧誘導(dǎo)的平滑肌細胞增殖具有濃度依賴性，在100 μmol∕L 濃度時能顯著抑制細胞活力，而50 μmol∕L 對細胞活力無顯著影響，但50 μmol∕L 能通過時間依賴性抑制低氧誘導(dǎo)的肺平滑肌細胞增殖。以上結(jié)果提示EGCG 能抑制低氧引起的肺動脈平滑肌細胞的增殖，從而減少肺心病的發(fā)生導(dǎo)致的呼吸衰竭。

本研究采用低氧誘導(dǎo)肺心病大鼠模型，經(jīng)不同劑量EGCG 藥物干預(yù)后，EGCG 各劑量組呼吸頻率、呼氣阻力、PEF 和PEP50 等肺功能相關(guān)指標及pH、PaO2和PaCO2等動脈血氣指標得到明顯改善，炎癥因子水平明顯下降，同時右心室肥大情況也有一定緩解，且EGCG 高劑量組與陽性對照組改善效果相當。研究結(jié)果提示EGCG 可減輕肺心病大鼠炎癥反應(yīng)，改善肺心病引起的機體損傷，減輕呼吸衰竭及不良反應(yīng)的發(fā)生。EGCG 作為茶多酚的主要藥理成分，國內(nèi)外研究大多針對抗氧化應(yīng)激和抗感染方面［19-22］，尚無針對呼吸衰竭改善方面的研究，是本文的一大創(chuàng)新之處。同時，EGCG的主要作用機制，特別是其細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)靶點，有待進一步研究。

綜上所述，EGCG 對低氧條件下引起的肺心病大鼠呼吸衰竭具有顯著的抑制作用。本研究可為茶多酚相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。