AKT1基因多態(tài)性與中國(guó)人群腦膜瘤易感性關(guān)系

黃冠又 郝淑煜 馮潔 王亮 張力偉 張俊廷 吳震

1貴陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科（貴陽550081）；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院（北京100070）；3首都醫(yī)

科大學(xué)北京市神經(jīng)外科研究所（北京100070）

腦膜瘤（meningiomas）是成人顱內(nèi)最常見的良性腫瘤［1］，女性多見，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的38.3%［2］。腦膜瘤的病因?qū)W目前尚未清楚，研究表明其發(fā)病可能與生活方式［3］、環(huán)境因素［4］及基因［5］、遺傳易感性［6］等多因素相關(guān)。手術(shù)切除和術(shù)后放療是其主要治療方式，雖大部分為良性，但術(shù)后復(fù)發(fā)率可達(dá)20%［7］。

PI3K∕AKT∕mTOR 通 路 是細(xì) 胞活 動(dòng)最 基本 的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，涉及細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等。AKT（蛋白激酶B）是PI3K 依賴的抑制凋亡的關(guān)鍵因子，AKT 及相關(guān)信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用［8-9］。AKT1 是AKT 亞型之一，研究發(fā)現(xiàn)其信號(hào)通路與癌癥、長(zhǎng)壽、心血管疾病密切相關(guān)［10］。研究［11-12］發(fā)現(xiàn)腦膜瘤細(xì)胞中存在異常活化和表達(dá)的AKT1 基因，其基因突變與腦膜瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展和復(fù)發(fā)可能有關(guān)。但關(guān)于AKTl基因多態(tài)性與腦膜瘤發(fā)生的關(guān)聯(lián)研究未見報(bào)道，本研究旨在探討AKT1 基因多態(tài)性與腦膜瘤的易感性關(guān)系，為腦膜瘤的發(fā)病和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采取以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究，選取并收集在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科中心于2017年10月至2018年1月手術(shù)治療及病理確診為腦膜瘤患者的臨床資料及外周靜脈血標(biāo)本。病理學(xué)診斷及腫瘤分級(jí)根據(jù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤WHO 2016年分類標(biāo)準(zhǔn)［13］。所有腦膜瘤患者及對(duì)照組人員均簽署知情同意書，選擇本院同期健康體檢者為對(duì)照組。本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并符合《赫爾辛基宣言》。200 例腦膜瘤組中，男54 例，女146 例，平均年齡（51.28±11.9）歲；200 例健康對(duì)照組中，男51 例，女149 例，平均年齡（48.52±10.17）歲。

1.2 DNA 提取和引物設(shè)計(jì) 每個(gè)受試者抽取外周靜脈血5 mL，所有血樣標(biāo)本以乙二胺四乙酸（EDTA）防止血液凝固，放置在-20 ℃低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩＠醚夯蚪MDNA 抽提試劑盒（上海生工技術(shù)有限公司）提取基因組DNA。引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI HapMap 上數(shù)據(jù)庫查找AKT1 基因在中國(guó)漢族人群中最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥0.1，以連鎖不平衡系數(shù)r2≥0.8為標(biāo)準(zhǔn)，下載AKT1 基因SNPs 數(shù)據(jù)信息，使用HaploView 軟件運(yùn)行HapMap 數(shù)據(jù)，選中篩選的SNPs，包括rs1130214、rs2494746、rs2494752 三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer3 設(shè)計(jì)引物。rs1130214 上游引物：5′-CCTGCTCCCCAGACTAGGAAAG-3′；下游引物：5′-CCCGGTACATGTTGGCCAAATGAA-3′，擴(kuò)增PCR片段長(zhǎng)度201 bp。rs2494746上游引物：5′-CTGACACCAAAGAGGGCTGTGA-3′；下游引物：5′-TTGGAGTGTTTGAGTGGGCAGCTA-3′，擴(kuò)增PCR 片段長(zhǎng)度240 bp。rs2494752 上游引物：5′-ACTGCTCCCCGAGGAAGAGTTC-3′；下游引物：5′-ACTTCAAGAACAGCCCGCAATGTC-3′，擴(kuò)增PCR 片段長(zhǎng)度204 bp。

1.3 PCR 反應(yīng)和基因分型 PCR 反應(yīng)條件：95 ℃2 min；11 cycles×（94 ℃20 s，65 ～0.5 ℃∕cycle 40 s，72 ℃1.5 min）；24 cycles×（94 ℃20 s，59 ℃30 s，72 ℃1.5 min）；72 ℃2 min；4 ℃for ever。PCR 產(chǎn)物使用ABI PRISM 3730XL 測(cè)序儀上測(cè)序，應(yīng)用多重單堿基延伸SNP 分型技術(shù)（Multiplex SNaPshot）進(jìn)行目的基因的多態(tài)性檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SHEsis在線軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg（HWE）平衡檢驗(yàn)分析和單體型（Haplotype）分析。采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率檢驗(yàn)比較腦膜瘤組和對(duì)照組中SNP 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布差異。應(yīng)用非條件logistic 回歸法分析各位點(diǎn)基因型與腦膜瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AKT1 基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因分布 經(jīng)HWE 檢驗(yàn)，在對(duì)照組中AKT1 基因三個(gè)SNP 位點(diǎn)rs1130214、rs2494746 和rs2494752 基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P=0.906 9、0.339 0、0.169 3），表明樣本來自同一人群，群體達(dá)到遺傳平衡。腦膜瘤組rs2494746 和rs2494752 位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1、2。

表1 腦膜瘤組和對(duì)照組AKT1 基因SNPs 的基因型分布Tab.1 Comparison of genotype distributions of AKT1 SNPs between two groups 例（%）

2.2 不同遺傳模型下AKT1 基因位點(diǎn)與腦膜瘤的易感性分析 根據(jù)不同遺傳模型（顯性模型、隱性模型和加性模型）分析AKT1三個(gè)SNPs 與腦膜瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性（經(jīng)性別、年齡因素校正，表3）。AKT1 基因位點(diǎn)rs1130214 在三種遺傳模型分布中，腦膜瘤組和對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。rs2494746位點(diǎn)在隱性和加性基因模型下，G 等位基因攜帶者患腦膜瘤的危險(xiǎn)性均顯著增加（均P＜0.05）。rs2494752 位點(diǎn)在隱性模型下，G等位基因攜帶者患腦膜瘤風(fēng)險(xiǎn)增加（P＜0.05）。

表3 非條件Logistic 回歸分析不同遺傳模型下AKT1 基因多態(tài)位點(diǎn)與腦膜瘤易感性關(guān)聯(lián)Tab.3 The association between AKT1 polymorphisms and meningioma susceptibility under different genetic models by unconditional logistic regression analysis

表2 腦膜瘤組和對(duì)照組AKT1 基因SNPs 的等位基因頻率分布Tab.2 Comparison of allele frequencies of AKT1 SNPs between two groups 例（%）

2.3 AKT1 基因多態(tài)性單體型分析 根據(jù)連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，AKT1 基因三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)rs1130214、rs2494746 和rs2494752 存在明顯連鎖不平衡（D′＞0.9，r2＞0.3，表4），由腦膜瘤組和對(duì)照組的三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)組成一個(gè)單體型塊（圖1）。單體型分析顯示，攜帶CCA單體型的患者腦膜瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低（P＜0.05），而CGA 和CGG 單體型在腦膜瘤組中分布頻率高于對(duì)照組，并且攜帶單體型CGA和CGG個(gè)體腦膜瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高（均P＜0.05），見表5。

表5 AKT1 基因多態(tài)位點(diǎn)單體型分析Tab.5 Haplotype analysis of polymorphism site of AKT1

圖1 AKT1 基因多態(tài)位點(diǎn)rs1130214，rs2494746 和rs2494752 構(gòu)成的連鎖不平衡圖Fig.1 Linkage disequilibrium map composed of the AKT1 polymorphic loci rs1130214，rs2494746 and rs2494752

表4 AKT1 基因多態(tài)位點(diǎn)間配對(duì)連鎖不平衡（LD）及r2Tab.4 Pairing linkage disequilibrium（LD）and r2 in the polymorphic loci of AKT1

3 討論

AKT1 基因是一種癌基因，定位于14q32.32，由14 個(gè)外顯子編碼，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和葡萄糖代謝，研究發(fā)現(xiàn)AKT1 在神經(jīng)元中普遍存在，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和記憶形成起關(guān)鍵作用，當(dāng)AKT1突變時(shí)能增加精神分裂癥、阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)［14-15］。

研究［16］發(fā)現(xiàn)腦膜瘤中PI3K∕AKT 信號(hào)通路存在異常活化，腦膜瘤中許多生長(zhǎng)因子通過受體酪氨酸激酶激活該通路，相關(guān)生長(zhǎng)因子受體在高級(jí)別甚至部分良性腦膜瘤中呈高表達(dá)，并且可通過自分泌或旁分泌環(huán)路參與腦膜瘤細(xì)胞的增殖、分化和遷移等。研究表明腦膜瘤患者存在AKT1 基因變異，研究較多的是編碼位于AKT1 基因pleckstrin 同源域的E17K 點(diǎn)突變，該點(diǎn)突變能導(dǎo)致AKT1 異常激活，其突變產(chǎn)生的腦膜瘤在病理亞型和生長(zhǎng)部位與NF2 突變腦膜瘤有所不同［17］。

目前關(guān)于AKT1 基因多態(tài)性與腫瘤易感性的關(guān)聯(lián)研究多集中在鼻咽癌、胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤［18］，雖然有研究表明PI3K∕AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腦膜瘤發(fā)生有關(guān)，但迄今未有從病因?qū)W角度分析PI3K∕AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵基因AKT1 基因多態(tài)性與腦膜瘤的關(guān)聯(lián)研究。本研究從NCBI Hap-Map 數(shù)據(jù)庫選取中國(guó)人群三個(gè)tagSNPs 位點(diǎn)，其中rs1130214 和rs2494746 均位于內(nèi)含子區(qū)，能調(diào)控基因的表達(dá)，rs2494752 位點(diǎn)位于AKT1 基因5′UTR區(qū)，為潛在的啟動(dòng)子區(qū)域，可影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，考慮到AKT1 基因可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，上述三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型變異可能會(huì)增加腦膜瘤的易感性。

本研究發(fā)現(xiàn)AKT1 基因三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，rs1130214 位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率在腦膜瘤組和健康對(duì)照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與腦膜瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)，表明位點(diǎn)rs1130214 可能不影響氨基酸編碼，在蛋白的功能改變上不起主要作用。但位點(diǎn)rs2494746 和rs2494752 基因型和等位基因分布在兩組間之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩位點(diǎn)多態(tài)性與腦膜瘤發(fā)病相關(guān)。在不同遺傳模型假定下，AKT1 基因rs2494746 位點(diǎn)在隱性和加性遺傳模型下，攜帶突變基因型個(gè)體患腦膜瘤風(fēng)險(xiǎn)增加。而位點(diǎn)rs2494752 在隱性遺傳模型下，等位基因G 攜帶者其腦膜瘤風(fēng)險(xiǎn)增加，表明這兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)攜帶突變型等位基因G 的個(gè)體能顯著增加腦膜瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。筆者推測(cè)位于潛在啟動(dòng)子區(qū)的rs2494752 位點(diǎn)和內(nèi)含子區(qū)位點(diǎn)rs2494746在突變等位基因G 作用下，能引起AKT1 基因表達(dá)水平的增加，導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)失調(diào)或蛋白功能改變，促使腦膜瘤細(xì)胞增殖或細(xì)胞凋亡受阻，可能對(duì)促進(jìn)腦膜瘤的發(fā)生產(chǎn)生一定作用。

位于染色體上某區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)SNP 等位位點(diǎn)稱為單體型，腦膜瘤是發(fā)病機(jī)制不明且原因復(fù)雜的疾病，單體型分型比單個(gè)SNP 分析更有優(yōu)勢(shì)［19］。本研究單體型分析顯示，CCA 單體型與腦膜瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)，該單體型是保護(hù)性因素。CGA 和CGG 單體型與腦膜瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。位點(diǎn)rs1130214 基因多態(tài)性與腦膜瘤無相關(guān)，但與位點(diǎn)rs2494746 和rs2494752 構(gòu)成的單體型CCA 卻能顯著降低腦膜瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，單體型CCA中包含位點(diǎn)rs1130214 的C 等位基因，筆者推測(cè)位于內(nèi)含子區(qū)的rs1130214 位點(diǎn)附近的遺傳改變可能在與5′UTR 區(qū)的位點(diǎn)rs2494752 遺傳變異影響下，共同作用于AKT1 基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，最終影響AKT1 基因活性及腫瘤細(xì)胞表型和凋亡途徑改變［20-21］。雖然位點(diǎn)rs2494746 和rs1130214 均位于內(nèi)含子區(qū)，不直接影響氨基酸編碼和蛋白功能，但這兩個(gè)位點(diǎn)能構(gòu)成較強(qiáng)的連鎖不平衡，與5′UTR 區(qū)的功能多態(tài)位點(diǎn)rs2494752 構(gòu)成的單體型CGA 和CGG 可能導(dǎo)致AKT1 基因活性增加，引起PI3K∕AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，最終增加患腦膜瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究顯示AKT1 基因兩個(gè)SNP（rs2494746 和rs2494752）對(duì)腦膜瘤的易感性影響，但腦膜瘤多為良性，發(fā)病原因除了遺傳易感性外，還與其他因素相關(guān)，因此還需結(jié)合臨床病理特征和相關(guān)因素進(jìn)行多維度研究。另外，本研究樣本量尚不足，且為單中心研究，沒有對(duì)患者預(yù)后情況進(jìn)行隨訪，今后還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步揭示腦膜瘤發(fā)生機(jī)制，為該病的診斷和治療提供依據(jù)。