降脂消斑片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血脂、IL-1β及Caspase-8的影響*

馮 君 盧豆豆，2 冉俊寧 唐聰聰 劉慧慧 劉建和△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004）

動(dòng)脈粥樣硬化是一組常見(jiàn)且重要的血管疾病，系指因吸煙、高血脂、糖尿病等多種危險(xiǎn)因素作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞后，致使內(nèi)皮功能受損、通透性改變、血脂大量沉積到內(nèi)膜下為主要特征的病理過(guò)程，晚期可堵塞管腔，阻滯血流，造成組織器官缺血缺氧，是心肌梗死、腦血管意外等多種危急病癥的重要危險(xiǎn)因素［1］。有研究發(fā)現(xiàn)［2-4］，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡均參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本文探討中藥對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血脂、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及半胱氨酸蛋白水解酶-8（Caspase-8）蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性C57BL/6J小鼠20只，體質(zhì)量20～25 g，4周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)DWDG-202009280002。采用高脂飼料喂養(yǎng)（7%豬油、5%膽固醇、3%白砂糖、0.5%膽酸鈉、84.5%基礎(chǔ)飼料）建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。所有小鼠均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，隨意飲食飲水，保持飼養(yǎng)室通風(fēng)情況良好，溫度（22±0.5）℃，晝夜交替12 h光照，均受人道對(duì)待。

1.2 藥物

降脂消斑片（院內(nèi)制劑，湘藥制備字Z20190067000），成分為大黃、虎杖、黃芪、當(dāng)歸，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，每粒0.4 g，成人用量為每次1.6 g，每日3次。阿托伐他汀鈣（輝瑞公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051408）。

1.3 試劑與儀器

蘇木精-伊紅染液（Wellbio）；IL-1β ELISA試劑盒（酶聯(lián)生物工程有限公司，01/2021）；Caspase-8蛋白抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Proteintech，66093-1-Ig）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，H1650R）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，PW-812）；多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，MB-530）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，DHP-500）；切片刀（萊卡，M199）；切片機(jī)（浙江金華益迪試驗(yàn)器材，YD-315）；包埋機(jī)（常州中威電子儀器，BMJA）；光學(xué)顯微鏡（Motic，BA410T）等。2.5%羧甲基纖維素鈉（阿拉丁，貨號(hào)C104984）。

1.4 分組及造模

小鼠經(jīng)檢疫后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，期間給予普通飼料，3 d后隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組、中藥組，每組5只，每鼠籠5只分開(kāi)飼養(yǎng)。分組完成后，正常組給予普通基礎(chǔ)飼料飲食，其余3組均給予動(dòng)脈粥樣硬化模型飼料（購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司），喂養(yǎng)12周建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。

1.5 給藥方法

喂養(yǎng)第6周時(shí)開(kāi)始藥物干預(yù)，預(yù)防性給藥6周。根據(jù)換算公式換算系數(shù)Rab=12.33，模型組給予2.5%羧甲基纖維素鈉水溶液1.5 mL/kg灌胃，西藥組給予阿托伐他汀鈣4.1 mg/kg灌胃，中藥組給予降脂消斑片984 mg/kg灌胃，每日1次。灌胃時(shí)間是每日上午給食前，每隔2～3 d記錄小鼠精神狀況、毛發(fā)光澤度、肢體活動(dòng)及體質(zhì)量。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 血脂檢測(cè) 12周后小鼠禁食12 h過(guò)夜，眼球取血，樣本在4℃冰箱放置過(guò)夜，1 500g離心10 min，吸取上層血清，放入專(zhuān)用試管，使用超微量動(dòng)物專(zhuān)用多功能全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.6.2 ELISA法檢測(cè)IL-1β 處死小鼠取20 mg主動(dòng)脈組織，用PBS洗去血污，剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入0.2 mL 1×PBS制成勻漿，然后置于-20℃過(guò)夜。經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融2次過(guò)夜處理破壞細(xì)胞膜后，將組織勻漿于2～8℃5 000g離心5 min取上清。取適量上清液立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用ELISA方法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)IL-1β的表達(dá)。

1.6.3 免疫組化法檢測(cè)Caspase-8蛋白 制作主動(dòng)脈組織切片，0℃烤片、切片脫蠟至水；熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，連續(xù)煮20 min后冷卻20 min拿出，冷卻至室溫。用0.01 mol/L PBS（pH7.2～7.6）洗滌3 min，重復(fù)3次；使用1%高碘酸室溫下10 min滅活內(nèi)源性酶；滴加鼠抗Caspase-8抗體（1∶100）孵育過(guò)夜，滴加二抗，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌終止顯色，脫水封片。應(yīng)用Image j軟件對(duì)每張圖片進(jìn)行分析，得出測(cè)量面積（A）與累積吸光度（IOD），IOD/A作為每一張圖片的平均光密度（AOD），AOD值越大，提示陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般體征比較

在適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，小鼠精神、活動(dòng)及皮毛均正常。造模期間，模型組、西藥組及中藥組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較正常組快，毛皮更為光亮。實(shí)驗(yàn)中后期，各組小鼠均生長(zhǎng)良好，模型組動(dòng)物情緒易怒，易被驚嚇，進(jìn)食量少。

2.2 各組小鼠血脂水平比較

見(jiàn)表1。與正常組相比，模型組TC、LDL-C水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明動(dòng)脈粥樣硬化模型建立成功；模型組、對(duì)照組及中藥組的TC、LDL-C水平較正常組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，各用藥組TC、LDL-C水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；西藥組與中藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠血清TC和LDL-C水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組小鼠血清TC和LDL-C水平比較（mmol/L，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別正常組模型組西藥組中藥組n 5 5 5 5 TC 2.23±0.16 4.56±1.01**3.67±0.70**△3.65±0.21**△LDL-C 0.47±0.11 1.88±0.68**0.89±0.15△△1.02±0.12*△△

2.3 各組小鼠炎癥因子IL-1β水平比較

見(jiàn)表2。與正常組相比，模型組血清中的IL-1β含量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥組的IL-1β含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；西藥組與中藥組無(wú)明顯差異。

表2 各組小鼠血清中IL-1β水平及主動(dòng)脈組織Caspase-8蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與西藥組比較，☆P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組Caspase-8 0.26±0.01 0.29±0.01**0.27±0.01△0.25±0.02△△☆n 5 5 5 5 IL-1β（ng/L）26.37±3.85 33.10±3.44**25.40±1.57△△26.21±4.45△△

2.3 各組小鼠主動(dòng)脈Caspase-8凋亡蛋白表達(dá)的比較

見(jiàn)表2，圖1。Caspase-8陽(yáng)性著色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中均勻分布棕黃色顆粒，主要表達(dá)在小鼠的主動(dòng)脈。與正常組比較，模型組Caspase-8的表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。與模型組相比，西藥組、中藥組Caspase-8表達(dá)均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與西藥組相比，中藥組Caspase-8表達(dá)下降更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

目前關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制有很多假說(shuō)，研究較多的是脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)。當(dāng)多種病損原因致使血管內(nèi)皮受損后，低密度脂蛋白逐漸沉積在管壁上，單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞募集到受損部位，并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，吞噬氧化后的低密度脂蛋白，完成清理工作的巨噬細(xì)胞變成泡沫細(xì)胞，而活化的巨噬細(xì)胞可釋放炎癥因子IL-1β和脂質(zhì)等物質(zhì)，吸引更多的單核細(xì)胞聚集，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，加劇動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。IL-1β屬于炎癥因子的一種，主要參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，可導(dǎo)致炎癥的持續(xù)與放大［5］。臨床研究表明［6］，動(dòng)脈粥樣硬化血清中的IL-1β較正常人明顯下降。Caspase是一類(lèi)同型半胱氨酸家族的蛋白，可在特定的氨基酸序列上切割底物，其中Caspase-8是與細(xì)胞凋亡最為密切的相關(guān)蛋白之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在細(xì)胞凋亡中占主導(dǎo)作用，廣泛表達(dá)于各種組織中，以血液淋巴細(xì)胞中表達(dá)最為豐富。細(xì)胞受到應(yīng)激原信號(hào)刺激后，可分泌TNF-α，募集多種蛋白包括TNFR1相關(guān)死亡域（TRADD）、受體相互作用蛋白激酶 1（RIPK1）、Caspase-8等組成復(fù)合體，Caspase-8的活化進(jìn)一步觸動(dòng)信號(hào)通路下游的其他Caspase因子，最終發(fā)動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)這一過(guò)程啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的開(kāi)始。故我們推測(cè)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡均與動(dòng)脈粥樣硬化的形成、發(fā)展相關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化在中醫(yī)古籍文獻(xiàn)中并無(wú)相對(duì)應(yīng)的名稱，根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)的“痰飲”“瘀血”“脈痹”“血濁”等范疇。恣食肥甘膏粱厚味之品，加重脾司運(yùn)化、胃主腐熟的負(fù)擔(dān)，運(yùn)化失司，代謝紊亂，水飲停聚，生成痰濕、脂濁，滯留血中；而濕又最易困脾，阻礙氣機(jī)，加重脾之虛弱。《金匱要略》記載“血不利則為水”，痰液阻道，氣機(jī)不利，可致血行不暢，變生瘀血，最終形成痰瘀膠結(jié)，滲透血脈。故選用高脂飼料誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型。

降脂消斑片是本院程丑夫教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合理論指導(dǎo)研制而成，主要由大黃、虎杖、黃芪、當(dāng)歸組成，應(yīng)用于臨床多年，療效確切。前期通過(guò)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［7-8］，降脂消斑片可減輕臨床癥狀，穩(wěn)定斑塊，還可降低患者血清中CRP、IL-1β等炎性指標(biāo)水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦表明［9-11］，該藥可降低血管內(nèi)皮脂質(zhì)浸潤(rùn)程度，下調(diào)TNF-α、PI3K等蛋白的表達(dá)，減輕粥樣斑塊的形成與進(jìn)展。方中虎杖具有“壓一切熱毒”之功，為君藥；大黃降氣通腑泄?jié)幔瑸槌妓帲划?dāng)歸補(bǔ)血活血，謂血中之氣藥，血中之圣藥，黃芪健脾益氣，升舉陽(yáng)氣，益氣行血，氣行則血行，二者配伍，共奏行氣活血之功，共為佐使藥。全方共奏升清降濁，化痰活血之功效。虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、當(dāng)歸揮發(fā)油等是方中的主要化學(xué)成分，實(shí)驗(yàn)表明可調(diào)節(jié)血脂紊亂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、改善血管內(nèi)皮損傷而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［12-15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組小鼠血清中TC、LDL-C含量顯著增加，說(shuō)明經(jīng)高脂飲食干預(yù)后，出現(xiàn)了明顯的血脂異常。與模型組相比，西藥組與中藥組的TC、LDL-C水平下降，表明阿托伐他汀鈣與降脂消斑片能糾正小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程中異常的血脂代謝。與正常組相比，模型組血清中的IL-1β表達(dá)含量顯著升高，提示炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程；免疫組化顯示模型組Caspase-8蛋白表達(dá)含量顯著高于正常組，提示細(xì)胞凋亡反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生；西藥組和中藥組Caspase-8表達(dá)顯著降低，表明阿托伐他汀鈣片與降脂消斑片可抑制動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的發(fā)生。

綜上所述，降脂消斑片通過(guò)參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血脂水平、炎癥及凋亡反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈組織的保護(hù)作用。本研究闡明了降脂消斑片抗動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，其具體通路機(jī)制可在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討研究。