Exo-miRNA在慢性心力衰竭患者中的表達及其臨床意義

蔡新勇 邵靚 劉員員 葉文兵 王桂根 王洪 賴珩莉 洪浪

摘要：目的 探討外泌體微小RNA（Exo-miRNA）在慢性心力衰竭（CHF）中的表達;方法 選取CHF患者95例（CHF組）和健康自愿者90例（對照組），采集外周血液，提取外泌體中miRNA，采用PCR法測定Exo-miRNA表達情況。結(jié)果 相較于對照組，CHF組Exo-miR-126、LVEF降低，Exo-miR-210、LVESD、LVEDD增高，P<0.001;隨著NYHA分級增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐漸減小，P<0.05;血清Exo-miR126與LVEF呈正相關(guān)，與LVESD、 LVEDD、Exo-miR210呈負相關(guān)，P<0.05;而血清Exo-miR210與LVEF呈負相關(guān)，而與LVESD、 LVEDD呈正相關(guān)，P<0.05;血清Exo-miR-126、Exo-miR-210聯(lián)合檢測診斷CHF的敏感度、特異度為80.25%、91.34%;結(jié)論 CHF患者血清Exo-miR-126表達下調(diào)，而Exo-miR-210表達增強，二者表達水平與CHF的心功能密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：外泌體;慢性心力衰竭;心功能;miR-126;miR-210

【中圖分類號】 R541.6 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）05--03

Abstract：Objective To investigate the expression of exosomal microRNA （Exo-miRNA） in chronic heart failure （CHF）;Methods 95 CHF patients （CHF group） and 90 healthy volunteers （control group） were selected， peripheral blood was collected， miRNA in exosomes was extracted， and the expression of Exo-miRNA was determined by PCR method.Results Compared with the control group， the CHF group had decreased Exo-miR-126 and LVEF， and increased Exo-miR-210， LVESD and LVEDD， P<0.001; with the increase of NYHA grade， serum Exo-miRNA-126 and LVEF gradually decreased ， P<0.05; serum Exo-miR126 was positively correlated with LVEF， and negatively correlated with LVESD， LVEDD， Exo-miR210， P<0.05; while serum Exo-miR210 was negatively correlated with LVEF， and positively correlated with LVESD， LVEDD， P <0.05; the sensitivity and specificity of combined detection of serum Exo-miR-126 and Exo-miR-210 in the diagnosis of CHF were 80.25% and 91.34%;Conclusion The expression of Exo-miR-126 in serum of CHF patients is down-regulated， while the expression of Exo-miR-210 is enhanced， and the expression levels of the two are closely related to the cardiac function of CHF.

Key words： exosomes; chronic heart failure; cardiac function; miR-126; miR-210

慢性心力衰竭（CHF）是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，目前全球范圍內(nèi)CHF的死亡率居高不下，再住院率逐年增加，其發(fā)生、發(fā)展及預后引起了學者的高度關(guān)注，成為臨床研究熱點。近年來學者發(fā)現(xiàn)基因表達調(diào)控在CHF的發(fā)病機制發(fā)揮著重要作用，并有研究指出[1]，外泌體微小RNA（Exo-miRNA）參與了心肌纖維化、心肌細凋亡、心肌重塑等多個CHF基本病理過程，其中外泌體miR-126和miR-210的作用尤為突出，二者具有促進血管新生和介導心臟祖細胞對低氧應激的抵抗力增強的作用[2，3]，并對心血管事件風險具有良好的預測價值[4]。但目前外周血外泌體miR-126、miR-210與CHF的相關(guān)研究鮮見報道。本研究擬探討CHF患者外周血外泌體中miR-126、miR-210表達情況，并分析其與CHF發(fā)病的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年3月～2021年12月本院心內(nèi)科收治的慢性心力衰竭（CHF）患者95例（CHF組），其中男52例，女43例，年齡46～75（61.20±8.75）歲，病程6個月～5年，平均（3.85±1.04）年，美國紐約心臟協(xié)會（NYHA）分級Ⅰ級25例，Ⅱ級27例，Ⅲ級22例，Ⅳ級21例。納入標準：符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》[5]中CHF診斷標準;NYHA心功能分級為I～IV級;同意參與本項研究并簽署知情同意書。排除標準：肝、腎功能嚴重損害;合并先天性心臟病、心肌梗死、心臟瓣膜病變等心臟疾病;有惡性腫瘤、自身免疫性疾病及心臟手術(shù)史者;有精神異常及依從性差者。同期選取本院健康體檢自愿者（心電圖檢查正常，且無心血管疾?。?0例為對照組，其中男49例，女性41例，年齡45～78（59.73±8.41）歲。CHF組與對照組受試者的性別（x2=0.002，P=0.968）、年齡（t=1.171，P=0.243）比較，差異無統(tǒng)計學意義，具可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

（1）外周血Exo-miRNA表達水平測定：①樣本采集與預處理：使用EDTA-K2 抗凝管采集CHF患者入院時及對照組人群晨起空腹靜脈血5mL，離心處理（離心半徑10cm，離心速度：3000r/min，時間：5min），分離血漿，-70℃保存待測。②血漿外泌體分離與裂解：取樣本解凍后，取500uL加入Exo Quick試劑（美國 SBI公司）120uL，振蕩充分混勻，4℃下放置3h;再10000r/min離心3min，移液槍吸取上清液棄去，下層即為外泌體顆粒;然后滴加350uL裂解緩沖液，渦流震蕩30s，4℃靜置10min，使其完全溶解。③外泌體RNA提取與純化：向上述外泌體液加入200ul無水乙醇，混勻，按miRcute miR親和柱（日本TIANGENS公司）試劑說明書提取、純化外泌體總RNA，并應有Nanodrop檢測總RNA質(zhì)

量與濃度;③ Exo-miRNA檢測：將上述純化的Exo-miRNA+20uL無菌雙蒸水溶解+12?LmiRNA反轉(zhuǎn)錄試劑（日本Takara公司），按反轉(zhuǎn)錄程序（45℃ 1h，95℃ 5min）進行逆轉(zhuǎn)錄，并設(shè)計引物（金斯瑞公司合成，具體序列見表1）進行PCR擴增，PCR擴增程序為預變性95℃ 5 min，變性95℃20 s，退火60℃20 s，共40個循環(huán)。擴增結(jié)束使用熒光定量PCR儀（美國Bio-RAD公司）測定miRNA相對表達量，以2-△△ct表示。

（2）心臟超聲檢測：使用HI VISION Ascendus勒超聲儀（日立公司）對受試對象行超聲心動圖檢查，探頭頻率為2. 5 MHz，測定左心室射血分數(shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑 （ LVESD）、 左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD） 等指標。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 20.00 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料（x±s）以獨立樣本t檢驗或方差分析，計數(shù)資料用x2檢驗，使用Pearson法分析Exo-miRNA表達與心功能參數(shù)的相關(guān)性，并繪制ROC曲線分析Exo-miRNA對CHF發(fā)生的預測價值，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清Exo-miRNA表達及心功能參數(shù)比較 見表2，CHF組Exo-miR-126、LVEF低于對照組，而Exo-miR-210、LVESD、LVEDD明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義，P<0.001。

2.2 不同NYHA分級CHF患者血清Exo-miRNA表達及心功能參數(shù)比較 見表3，不同NYHA分級CHF患者血清Exo-miRNA-126、Exo-miRNA-210水平及心功能參數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義，P<0.05;且隨著NYHA分級增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐漸減小，而LVESD、 LVEDD逐漸增大，差異均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

2.3 CHF患者血清Exo-miRNA表達與心功能參數(shù)的關(guān)系 見表4，血清Exo-miR126與LVEF呈顯著正相關(guān)，而與LVESD、 LVEDD呈負相關(guān)，P<0.05;血清Exo-miR210與LVEF呈負相關(guān)，而與LVESD、 LVEDD呈正相關(guān)，P<0.05;血清Exo-miR126與Exo-miR210呈負相關(guān)，P<0.05。

2.4 血清Exo-miRNA表達對CHF發(fā)生的診斷效能 血清Exo-miR-126、Exo-miR-210預測CHF發(fā)生的ROC曲線結(jié)果，血清Exo-miR-126最佳截斷值取25.34時診斷CHF的AUC為0.905（95%CI：0.826～0.913，P<0.001），Exo-miR-210最佳截斷值取27.12時診斷CHF的AUC為0.848（95%CI：0.712～0.853，P<0.05），二者聯(lián)合檢測診斷CHF的AUC為0.953（95%CI：0.759～0.916，P<0.001），敏感度和特異度依次為80.25%、91.34%，見表5。

3 討論

CHF可導致心排出量下降、心室充血，繼而導致組織血供不足和循環(huán)淤血，對心臟造成不可逆損害[6]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)[7]，我國CHF患病率為1.3%，患病人數(shù)約1370萬人，5年內(nèi)死亡率達50%。早期發(fā)現(xiàn)并評估病情嚴重程度對改善CHF患者預后具有重要意義。外泌體是細胞間信息交流的工具，也是miRNA的重要載體，由于外泌體內(nèi)miRNA因被雙層膜狀結(jié)構(gòu)包裹，相較于血清miRNA，其具有更好的穩(wěn)定性、更高的靈敏度和特異性[8-9];這也使得外泌體miRNA成為CHF早期診斷的潛在生物標志物。

心肌細胞間進行信息交流期間，細胞會富集特異性miRNA，并包裝進外泌體，然后釋放至細胞間隙，參與心臟的心臟病理生理學變化[10]。miR-126在調(diào)控血管新生和血管內(nèi)皮損傷修復方面均發(fā)揮重要作用，與心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]，CHF患者外周血中miR-126表達較健康人群顯著下調(diào)，但將miR-126轉(zhuǎn)染入CHF患者體內(nèi)后，其心臟功能能迅速改善。而miR-210是缺氧調(diào)控的重要基因，其在缺氧生理狀態(tài)下明顯升高[13];并有學者發(fā)現(xiàn)miR-210在心肌細胞凋亡與增殖、心肌細胞再生及缺血心肌組織血管新生等方面的調(diào)控中均發(fā)揮著重要的作用[14-15]?？梢?，miR-126、miR-210在心臟疾病發(fā)病中的重要作用，本研究通過測定血清外泌體miRNA發(fā)現(xiàn)，CHF組Exo-miR-126、LVEF低于對照組，而Exo-miR-210、LVESD、LVEDD明顯高于對照組，表明CHF患者血清外泌體miR-126、miR-210表達異常，與類似研究報道結(jié)果相符[16-17]，由此推測miR-126、miR-210參與了CHF的發(fā)生。CHF發(fā)病后心臟負荷增加、心肌缺血缺氧損傷，繼而導致心室重構(gòu)，LVESD、LVEDD 增大，LVEF減小，心功能逐漸變差[18]，同時缺氧環(huán)境會刺激miR-210增加，而內(nèi)皮細胞分泌miR-126則受到抑制，由此導致了CHF外泌體miR-210、miR-126表達異常。此外，本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，不同NYHA分級CHF患者血清Exo-miRNA-126、Exo-miRNA-210水平及心功能參數(shù)存在顯著差異，且隨著NYHA分級增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐漸減小，而LVESD、 LVEDD逐漸增大;相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清Exo-miR126與LVEF呈顯著正相關(guān)，而與LVESD、 LVEDD呈負相關(guān);而血清Exo-miR210與心功能參數(shù)的關(guān)系與Exo-miR126正好相反，Exo-miR126與Exo-miR210呈顯著負相關(guān)，這提示外泌體miR126、miR210參與調(diào)控了CHF的疾病進展，可作為CHF病情判斷的參考指標，與研究報道結(jié)果相符[19-20]。

另外，本研究結(jié)果顯示，Exo-miR-126、Exo-miR-210診斷CHF發(fā)生的特異度和靈敏度依次為73.10%和 88.51%、70.92%和89.24%，二者聯(lián)合檢測的特異度和靈敏度可提升至80.25%、91.34%，提示Exo-miR-126、Exo-miR-210在CHF的臨床診斷中具有較高的特異度和敏感性，二者聯(lián)合檢測可提升CHF的診斷效能，為CHF的早期臨床治療提供參考。

綜上所述，CHF患者血清Exo-miR-126表達下調(diào)，而Exo-miR-210表達增強，二者表達水平與CHF的心功能密切相關(guān)，可作為CHF臨床早期診斷的潛在生物標志物。

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第一作者：蔡新勇，男、碩士;副主任醫(yī)師、江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西省南昌市豐和北大道266號，cxyandcxy@163.com，研究方向：冠心病、缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化

通訊作者：邵靚，男、博士;副主任醫(yī)師、江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西省南昌市豐和北大道266號，E-mail： shaoliang021224@hotmail.com 研究方向：心衰、心肌病、腫瘤心臟病學

基金項目：江西省衛(wèi)生計生委科技計劃課題項目合同號202130031