20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑高效液相色譜分析

蘇君一，李 敏，趙燕杰，徐 妍，劉細平，陶 婧，康占海*

（1.河北農業大學，河北保定 071000；2.北京宇悅生物科技有限公司，北京 100089）

氟唑菌酰胺（Fluxapyroxad），化學名稱為3-(二氟甲基)-1-甲基-N-(3,4,5-三氟[1,1-聯苯]-2-基)-1-吡唑-4-甲酰胺[1]，屬于羧酰胺類殺菌劑，是巴斯夫公司研發的核心產品[2]。氟唑菌酰胺主要是通過利用抑制病原線粒體呼吸鏈復合體Ⅱ中琥珀酸脫氫酶的活性，從而進一步抑制病原菌孢子萌發及芽管和菌絲體的正常生長[3]。其作用方式不同于現有殺菌劑，同時又兼具普通殺菌劑所具有的廣譜、高效等特點，已成為殺菌劑研究的新熱點[4]。肟菌酯（Trifloxystrobin），又名肟草酯，化學名稱為甲基(E)-甲氧基亞胺基-{(E)-α-[α,α,α-三氟-m-甲苯基)-亞乙基氨基氧基]-鄰甲苯基}乙酸甲酯，屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[5]，對真菌類病害如白粉病、銹病、潁枯病、稻瘟病等均具有良好的毒殺性能[6]。其主要作用于莖葉，同時有一定的治療性能，有效成分對環境的影響可忽略不計，在孢子萌發和發病初期應用最佳[7]。

目前，國內關于氟唑菌酰胺、肟菌酯的高效液相色譜分析方法均有報道[8-9]，而這一混劑產品的同條件分析方法目前尚未見報道。基于這種現象，本研究采用高效液相色譜法，用C18反相柱和紫外檢測器，對20%氟唑菌酰胺·肟菌酯進行分析和定量，此液相方法同時適用于氟唑菌酰胺和肟菌酯原藥以及制劑的分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津Essentia LC-16型高效液相色譜儀裝配有紫外可變波長檢測器和自動進樣器，島津企業管理（中國）有限公司；乙腈（色譜純），北京邁瑞達科技有限公司；氟唑菌酰胺標樣（純度≥99.0%）、肟菌酯標樣（純度≥99.0%）、20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑，北京宇悅生物科技有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標樣溶液的配制

分別稱取0.021 0 g氟唑菌酰胺和0.021 4 g肟菌酯標準品，置于50 mL容量瓶中，用流動相溶解、定容后，過膜備用。

1.2.2 試樣溶液的配制

稱20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑樣品0.201 4 g于50 mL的容量瓶中，用流動相溶解、定容后，過膜備用。

1.3 色譜條件

色譜柱是ZORBAX SB-C18不銹鋼柱（250 mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：270 nm；流動相：乙腈-0.1%乙酸水（70∶30，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10μL；柱溫：30℃；保留時間：氟唑菌酰胺約4.6 min；肟菌酯約10.5 min。在以上色譜條件下，氟唑菌酰胺和肟菌酯標樣和試樣液相色譜圖分別為圖1、圖2。

圖1 氟唑菌酰胺和肟菌酯標樣液相色譜圖

圖2 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑試樣液相色譜圖

1.4 測定

在上述1.3色譜條件下待儀器基線穩定后，連續進樣數針標準品溶液，直到相鄰2針氟唑菌酰胺與肟菌酯峰面積的相對變化率小于1.5%時，按照標準品溶液、試樣溶液、試樣溶液、標準品溶液的順序進行測定，用外標法計算氟唑菌酰胺及肟菌酯的含量。

1.5 計算

取2針平行標樣和試樣峰面積的平均值，按式（1）計算懸浮劑中2種有效成分的質量分數w，%。

式中：A1、A2分別為標樣、試樣峰面積平均值，mAU·min；m1、m2分別為標樣、試樣質量，g；P為標樣含量質量比，%。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇

選擇合適的流動相是液相色譜分離效果的關鍵。分別以甲醇和乙酸水、乙腈和乙酸水為流動相對樣品進行分離檢測。根據檢測結果，把乙腈和乙酸水作為流動相，出鋒時間短，鋒形尖銳，最終選定流動相的比例為V乙腈∶V0.1%乙酸水=70∶30。

2.1.2 檢測波長的選擇

通過紫外全波長掃描得到氟唑菌酰胺和肟菌酯相應的吸收波長和響應值。當波長為270 nm時，2種活性成分的吸收峰較強，雜質的響應值較小，因此檢測波長為270 nm。

2.2 分析方法的線性相關性

按照系列稀釋的方法配制5個不同質量濃度的氟唑菌酰胺及肟菌酯標準品溶液，在上面所述色譜分析條件進行測定，以質量濃度和峰面積為橫、縱坐標繪制標準曲線。氟唑菌酰胺線為y=10 786x＋70 257，R2=0.999 7；肟菌酯為y=15 805x＋51 379，R2=0.999 7。二者R2均大于0.999，說明該方法線性關系良好。

2.3 分析方法的精密度

在選定的色譜操作條件下，對同一個20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑樣品平行測定5次，計算氟唑菌酰胺和肟菌酯的標準偏差分別為0.040%和0.030%，變異系數分別為0.39%和0.30%（表1）。

表1 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑精密度試驗結果

2.4 分析方法的準確度

稱取5個已知確定質量分數的20%氟唑·肟菌酯浮劑樣品，每個樣品都加入一定量的氟唑菌酰胺和肟菌酯標準品，按照選定的色譜條件測定樣品中氟唑菌酰胺和肟菌酯的總質量，并計算其平均回收率。由表2可知，氟唑菌酰胺和肟菌酯的平均回收率分別是100.60%和100.14%。

表2 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑回收率試驗

2.5 非分析物干擾的分析

當我們在試驗判定這種分析方法是否具有準確性時，還應包括非分析物質的干擾試驗，有效成分中的任何干擾物都會導致分析方法出現系統誤差。分析時應同時測定不含有效成分的空白樣品，其證明樣品沒有被干擾。通過對溶劑、空白樣品、原藥等在1.3色譜條件進行分析溶劑及空白樣品對分析無干擾，分離度高于1.5%，對有效成分的定性定量分析均無明顯影響，所以本試驗的分析方法未受到干擾。

3 結 論

本試驗建立了一個關于20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑中有效成分的液相分析技術，精密度和測定準確度較高，線性關系良好，試驗操作簡便，是該類產品質量檢測最為理想的方法。