20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑高效液相色譜分析

蘇君一，李 敏，趙燕杰，徐 妍，劉細(xì)平，陶 婧，康占海*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定 071000；2.北京宇悅生物科技有限公司，北京 100089）

氟唑菌酰胺（Fluxapyroxad），化學(xué)名稱為3-(二氟甲基)-1-甲基-N-(3,4,5-三氟[1,1-聯(lián)苯]-2-基)-1-吡唑-4-甲酰胺[1]，屬于羧酰胺類殺菌劑，是巴斯夫公司研發(fā)的核心產(chǎn)品[2]。氟唑菌酰胺主要是通過利用抑制病原線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ中琥珀酸脫氫酶的活性，從而進(jìn)一步抑制病原菌孢子萌發(fā)及芽管和菌絲體的正常生長(zhǎng)[3]。其作用方式不同于現(xiàn)有殺菌劑，同時(shí)又兼具普通殺菌劑所具有的廣譜、高效等特點(diǎn)，已成為殺菌劑研究的新熱點(diǎn)[4]。肟菌酯（Trifloxystrobin），又名肟草酯，化學(xué)名稱為甲基(E)-甲氧基亞胺基-{(E)-α-[α,α,α-三氟-m-甲苯基)-亞乙基氨基氧基]-鄰甲苯基}乙酸甲酯，屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[5]，對(duì)真菌類病害如白粉病、銹病、潁枯病、稻瘟病等均具有良好的毒殺性能[6]。其主要作用于莖葉，同時(shí)有一定的治療性能，有效成分對(duì)環(huán)境的影響可忽略不計(jì)，在孢子萌發(fā)和發(fā)病初期應(yīng)用最佳[7]。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于氟唑菌酰胺、肟菌酯的高效液相色譜分析方法均有報(bào)道[8-9]，而這一混劑產(chǎn)品的同條件分析方法目前尚未見報(bào)道。基于這種現(xiàn)象，本研究采用高效液相色譜法，用C18反相柱和紫外檢測(cè)器，對(duì)20%氟唑菌酰胺·肟菌酯進(jìn)行分析和定量，此液相方法同時(shí)適用于氟唑菌酰胺和肟菌酯原藥以及制劑的分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津Essentia LC-16型高效液相色譜儀裝配有紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；乙腈（色譜純），北京邁瑞達(dá)科技有限公司；氟唑菌酰胺標(biāo)樣（純度≥99.0%）、肟菌酯標(biāo)樣（純度≥99.0%）、20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑，北京宇悅生物科技有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)樣溶液的配制

分別稱取0.021 0 g氟唑菌酰胺和0.021 4 g肟菌酯標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解、定容后，過膜備用。

1.2.2 試樣溶液的配制

稱20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑樣品0.201 4 g于50 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相溶解、定容后，過膜備用。

1.3 色譜條件

色譜柱是ZORBAX SB-C18不銹鋼柱（250 mm×4.6mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.1%乙酸水（70∶30，V/V）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：30℃；保留時(shí)間：氟唑菌酰胺約4.6 min；肟菌酯約10.5 min。在以上色譜條件下，氟唑菌酰胺和肟菌酯標(biāo)樣和試樣液相色譜圖分別為圖1、圖2。

圖1 氟唑菌酰胺和肟菌酯標(biāo)樣液相色譜圖

圖2 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑試樣液相色譜圖

1.4 測(cè)定

在上述1.3色譜條件下待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)進(jìn)樣數(shù)針標(biāo)準(zhǔn)品溶液，直到相鄰2針氟唑菌酰胺與肟菌酯峰面積的相對(duì)變化率小于1.5%時(shí)，按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算氟唑菌酰胺及肟菌酯的含量。

1.5 計(jì)算

取2針平行標(biāo)樣和試樣峰面積的平均值，按式（1）計(jì)算懸浮劑中2種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w，%。

式中：A1、A2分別為標(biāo)樣、試樣峰面積平均值，mAU·min；m1、m2分別為標(biāo)樣、試樣質(zhì)量，g；P為標(biāo)樣含量質(zhì)量比，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

選擇合適的流動(dòng)相是液相色譜分離效果的關(guān)鍵。分別以甲醇和乙酸水、乙腈和乙酸水為流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行分離檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，把乙腈和乙酸水作為流動(dòng)相，出鋒時(shí)間短，鋒形尖銳，最終選定流動(dòng)相的比例為V乙腈∶V0.1%乙酸水=70∶30。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過紫外全波長(zhǎng)掃描得到氟唑菌酰胺和肟菌酯相應(yīng)的吸收波長(zhǎng)和響應(yīng)值。當(dāng)波長(zhǎng)為270 nm時(shí)，2種活性成分的吸收峰較強(qiáng)，雜質(zhì)的響應(yīng)值較小，因此檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

2.2 分析方法的線性相關(guān)性

按照系列稀釋的方法配制5個(gè)不同質(zhì)量濃度的氟唑菌酰胺及肟菌酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上面所述色譜分析條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度和峰面積為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氟唑菌酰胺線為y=10 786x＋70 257，R2=0.999 7；肟菌酯為y=15 805x＋51 379，R2=0.999 7。二者R2均大于0.999，說明該方法線性關(guān)系良好。

2.3 分析方法的精密度

在選定的色譜操作條件下，對(duì)同一個(gè)20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑樣品平行測(cè)定5次，計(jì)算氟唑菌酰胺和肟菌酯的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.040%和0.030%，變異系數(shù)分別為0.39%和0.30%（表1）。

表1 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 分析方法的準(zhǔn)確度

稱取5個(gè)已知確定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的20%氟唑·肟菌酯浮劑樣品，每個(gè)樣品都加入一定量的氟唑菌酰胺和肟菌酯標(biāo)準(zhǔn)品，按照選定的色譜條件測(cè)定樣品中氟唑菌酰胺和肟菌酯的總質(zhì)量，并計(jì)算其平均回收率。由表2可知，氟唑菌酰胺和肟菌酯的平均回收率分別是100.60%和100.14%。

表2 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑回收率試驗(yàn)

2.5 非分析物干擾的分析

當(dāng)我們?cè)谠囼?yàn)判定這種分析方法是否具有準(zhǔn)確性時(shí)，還應(yīng)包括非分析物質(zhì)的干擾試驗(yàn)，有效成分中的任何干擾物都會(huì)導(dǎo)致分析方法出現(xiàn)系統(tǒng)誤差。分析時(shí)應(yīng)同時(shí)測(cè)定不含有效成分的空白樣品，其證明樣品沒有被干擾。通過對(duì)溶劑、空白樣品、原藥等在1.3色譜條件進(jìn)行分析溶劑及空白樣品對(duì)分析無干擾，分離度高于1.5%，對(duì)有效成分的定性定量分析均無明顯影響，所以本試驗(yàn)的分析方法未受到干擾。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了一個(gè)關(guān)于20%氟唑菌酰胺·肟菌酯懸浮劑中有效成分的液相分析技術(shù)，精密度和測(cè)定準(zhǔn)確度較高，線性關(guān)系良好，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，是該類產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)最為理想的方法。