高效液相色譜法測定牛奶中3種防腐劑

馬曉年，陳俊秀，農蕊瑜，李文廷，蔣夢

（1.昆明市疾病預防控制中心，昆明 650228；2.昆明醫科大學，昆明 650500）

0 引言

牛奶能為人體提供多種營養物質[1]，在日常生活中不可或缺。食品防腐劑具有良好的殺菌作用[2]，能延長食品保質期，被廣泛應用于食品加工中。

少量的食品添加劑對人體沒有影響，過量則會對人體健康造成損害[3]。國標對于食品防腐劑的添加做出了明確規定[4]，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸不能添加到牛奶中。目前,國內的研究中檢測3種防腐劑的方法主要有：氣相色譜法[5-7]、液相色譜法[8-10、13-14]、薄層色譜法[11]，但能同時快速檢測3種防腐劑的方法較少。本文對實驗條件進行研究改進，建立了高效液相色譜法同時測定牛奶中3種防腐劑。結果表明，該法快速、準確、簡便，適合于日常檢驗。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo U3000高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器）,美國賽默飛;高速冷凍離心機，湖南 赫西儀器;電子天平（0.01 mg）,Sartorius。

牛奶，市購；苯甲酸（壇墨質檢-標準物質中心）；山梨酸、脫氫乙酸，壇墨質檢-標準物質中心；甲醇（色譜純），美國JT Baker；乙腈（色譜純）、磷酸二氫鉀（分析純）、乙酸胺（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；乙酸（分析純），北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

準確量取苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸標準溶液各1 mL，用純水定容至10 mL，得到苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸均為100μg/mL的混合標準應用液?；旌蠘藴蕬靡罕４嬗?℃冰箱內備用。

1.2.2 樣品前處理

0.2 %乙酸沉淀法：準確稱取2 g樣品于50 mL離心管中,加入10 mL體積分數為0.2%乙酸水溶液,渦旋2 min,于轉速4 000 r/min離心1 min,留取上清液,殘渣重復上述操作兩次,合并水相,并用體積分數0.2%乙酸溶液定容至30 mL,混勻。取適量上清液過0.22μm濾膜,待液相色譜測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A為濃度0.02 mol/L乙的酸銨溶液，流動相B為乙腈,梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為230 nm；進樣量為10μL；柱溫為室溫。洗脫條件如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 檢測波長的選擇

在200～300 nm范圍內對分析物進行紫外波長掃描，結果發現,在流動相中3個組分的最大吸收波長分別是苯甲酸230 nm、山梨酸254 nm、脫氫乙酸230 nm。為兼顧各組分的靈敏度和吸收峰值，在實驗中對比254 nm和230 nm波長處取得的混合組分色譜圖，根據各組分紫外吸收情況，確定在230 nm波長處檢測苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸均取得更高響應如見圖1所示，故選用230 nm作為本實驗的檢測波長。

圖1 不同檢測波長下3種物質的標準色譜

2.1.2 流動相的選擇

本文實驗了甲醇-乙酸銨、乙腈-乙酸銨、乙腈-磷酸二氫鉀，并調整有機相及水相比例以得到最佳的分離效果。實驗表明，磷酸二氫鉀作為水相時，在不改變pH的情況下，苯甲酸和山梨酸無法實現基線分離，改變流動相比例改善效果也并不顯著；乙酸銨作為水相則可較好的分離3種防腐劑，甲醇作為有機相，3種防腐劑均可實現基線分離，分析時間約為15 min；乙腈作為有機相，3種防腐劑均實現基線分離且峰型收窄，響應增大，分析時間在7 min內如見圖2所示。綜上所述，本文選擇乙腈-乙酸銨作為流動相進行后續分析工作。

圖2 不同流動相下3種物質的標準色譜圖

2.2 樣品前處理方法的確定

牛奶樣品中的蛋白質會干擾測定結果，故需除去蛋白質。目前除蛋白有沉淀法和萃取法兩大類[15]。實驗主要考察了沉淀法中的GB 5009.28-2016[12]無機試劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀蛋白及有機試劑沉淀蛋白。

本文對苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸進行加標6次重復平行實驗，對比3種方法的加標回收率和相對偏差值,結果如表2所示。實驗發現，國標方法過程較為繁瑣，苯甲酸的回收率在82.6%～116.2%，雖達到方法驗證學的要求，但RSD大于10%，實驗重復性不佳；山梨酸的回收率較低，在60.6%～70.0%；脫氫乙酸的回收率則完全達不到方法學要求。

表2 不同前處理方法樣品的平均加標回收率

本文試驗了甲醇及乙酸兩種有機溶劑沉淀蛋白。采用甲醇沉淀蛋白質對苯甲酸、山梨酸的回收率基本達到要求，但實驗中存在沉淀不完全的現象，且脫氫乙酸的回收率低至56.8%~70%。乙酸對水的親和力較大，能破壞蛋白質顆粒的水化膜，在等電點時使蛋白質沉淀，故體積分數為0.2%乙酸沉淀法能克服實驗過程繁瑣、沉淀不完全兩個缺點，取得理想效果，對3種組分的回收率在82.3%～104.0%，RSD在4.5%～5.6%。綜合考 慮，因而選擇體積分數0.2%乙酸作為蛋白質沉淀劑。

2.3 樣品提取次數的選擇

試驗按樣品前處理的步驟，對比了體積分數為0.2%乙酸分別對加標樣品進行1次和3次提取，最后用體積分數為0.2%乙酸定容至30 mL，每個加標水平重復4次，得出樣品的平均加標回收率和RSD值，實驗結果如表3所示。

表3 不同提取次數的樣品加標回收率

從表中可以看出，采用3次提取各組分的加標回收率均優于1次提取，且3次提取的RSD值小于1次提取，重復性較好。為確保實驗準確性，實驗再次使用體積分數為0.2%乙酸進行4次提取，發現其平均回收率在88.4%～95.1%，和3次提取結果無顯著性差異，因而提取次數選擇3次。

2.4 標準曲線及檢出限

用純水將混合標準應用液配制成含苯甲酸質量濃度分別為1.56，12.5，25.0，50.0，100.0μg/mL；含山梨酸質 量 濃 度 分 別 為0.78，6.25，12.5，25.0，50.0μg/mL；含脫氫乙酸質量濃度分別為3.12，6.25，12.5，25.0，50.0μg/mL的標準工作溶液；在確定的分析條件下進行測定，采用外標法以峰面積計算定量,以質量濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到的線性方程、相關系數、檢出限及定量限如表4所示。

表4 3種組分的線性方程、相關系數、檢出限及定量限mg/g

2.5 回收率和精密度實驗

取不含苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的牛奶樣品，加入高中低3個濃度梯度的防腐劑混標，加標濃度分別見表5，分別測定6次，計算其平均回收率和精密度。苯甲酸平均回收率在86.7%～101.0%，RSD在3.6%～5.7%；山梨酸平均回收率在83.4%～91.9%，RSD在4.4%～6.0%；脫氫乙酸平均回收率在90.1%～97.2%，RSD在3.9%～5.1%。圖3為牛奶樣品加入3種混標的色譜圖，由圖可見，3種組分與雜質峰完全分離，無干擾，可準確定性、定量檢測。

表5 樣品加標回收率結果

圖3 加標樣品色譜圖

3 結論

在本方法的條件下，3種防腐劑與牛奶中其他干擾雜質峰完全分離，在10 min內可快速檢測出，且定量準確?？梢怨澕s檢測成本并提高檢測效率，適合牛奶中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的日常監控測定。