高效液相色譜法檢測熟制豬肉中呈味核苷酸

黎琪 李曉敏 姜德銘 檀馨悅 王晴 張曉琳

摘? 要：以市場上2 款黑豬和2 款白豬通脊肉和五花肉為研究對象，對比分析其熟制后肉和湯中5-肌苷酸、5-腺苷酸、5-鳥苷酸、肌苷和次黃嘌呤的含量差異。結果表明：豬肉中5-肌苷酸含量明顯高于其他核苷酸，且五花肉中呈味核苷酸含量遠低于通脊肉;白豬肉和湯中5-肌苷酸含量均顯著高于黑豬肉（P<0.05），肌苷與次黃嘌呤含量總體上低于黑豬肉，白豬BZ1通脊肉和BZ2五花湯中5-腺苷酸含量最高，白豬BZ2通脊肉5-鳥苷酸含量最高，黑豬HZ1五花肉5-鳥苷酸含量最低。綜上，白豬肉在鮮味呈現上比黑豬肉更具優勢，白豬BZ1最佳，黑豬HZ1最差。

關鍵詞：高效液相色譜法;豬肉;鮮味;呈味核苷酸;5-肌苷酸

Determination of Flavor-Active Nucleotides in Cooked Pork by High Performance Liquid Chromatography

LI Qi¹， LI Xiaomin¹， JIANG Deming^1，2， TAN Xinyue¹， WANG Qing¹， ZHANG Xiaolin^1，2，*

（1.Beijing Engineering Laboratory of Geriatric Nutrition and Food， Beijing Key Laboratory of Nutrition and Health and Food Safety， COFCO Nutrition and Health Research Institute Co. Ltd.， Beijing?? 102209， China; 2.Beijing Engineering Research Center of Livestock Products Quality and Safety Source Control， Beijing?? 102209， China）

Abstract： Pork tenderloins and bellies from black （HZ1 and HZ2） and white （BZ1 and BZ2） pigs from two different producers were cooked in boiling water， and the differences in the contents of 5-inosine acid， 5-adenosine acid， 5-guanosine acid， inosine and hypoxanthine in the cooked meat and broth samples were analyzed in this study. The results showed that inosine acid was significantly more abundant than other nucleotides in pork meat， and the contents of flavor-active nucleotides were much lower in pork belly than in tenderloin. The content of inosine acid was significantly higher in the cooked meat and broth of white pigs than black pigs （P< 0.05）， while the contents of inosine and hypoxanthine were lower than those in black pigs. The content of 5-adenosine acid in cooked tenderloin BZ1 and the broth of belly BZ2 were the highest among the same type of samples. The content of 5-guanosine acid was the highest in cooked tenderloin BZ2， and lowest in cooked belly HZ1. In conclusion， the meat of white pigs is advantageous over the meat of black pigs in presenting umami flavor， regardless of the cut. BZ1 shows the best umami flavor， while HZ1 is the worst.

Keywords： high performance liquid chromatography; pork; umami; flavor-active nucleotides; inosine acid

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211213-237

中圖分類號：TS251.51????????????? 文獻標志碼：A??????????? 文章編號：

引文格式：

黎琪， 李曉敏， 姜德銘， 等. 高效液相色譜法檢測熟制豬肉中呈味核苷酸[J]. 肉類研究， 2022， 36（3）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211213-237.??? http：//www.rlyj.net.cn

LI Qi， LI Xiaomin， JIANG Deming， et al. Determination of flavor-active nucleotides in cooked pork by high performance liquid chromatography[J]. Meat Research， 2022， 36（3）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211213-237.??? http：//www.rlyj.net.cn

滋味是豬肉的主要風味之一，其在肉品品質評價中起著至關重要的作用^[1]。鮮味作為五大基本滋味之一^[2]，更是消費者所追求的關鍵感官品質。豬肉中呈鮮味的物質包括游離氨基酸及其鹽類、核苷酸及其鹽類、無機鹽類、有機酸類和肽類等^[3]，其中主要鮮味氨基酸為谷氨酸和天冬氨酸^[4]，主要鮮味核苷酸為5-肌苷酸、5-腺苷酸和5-鳥苷酸^[5]。肉中5-肌苷酸和5-腺苷酸由三磷酸腺苷酶解生成^[6]，5-鳥苷酸主要存在于少數植物和微生物中，在畜禽肉中含量極低，但鮮味是5-肌苷酸的3～4 倍^[7]。不同核苷酸對肉的整體風味具有復雜的影響，5-肌苷酸降解產物肌苷與次黃嘌呤具有苦味，會給肉的整體風味帶來負面作用^[8]。因此全面分析豬肉中呈味核苷酸的種類和含量對于了解豬肉的風味特征具有重要意義。

肉中呈味核苷酸的含量受貯運條件^[9]、加工方式^[10]和檢測方法的影響較大。針對呈味核苷酸的檢測方法，目前有離子交換色譜法^[11]、毛細管電泳法^[12]、液相色譜-質譜聯用法^[13]、紫外分光光度法^[14]和高效液相色譜法^[15]等，其中高效液相色譜法應用最普遍。當前研究報道中的檢測方法存在分析時間較長、檢測物質偏少等問題，且一般以生豬背最長肌為研究對象，一定程度上無法全面反映熟制豬肉的呈味核苷酸特征。本研究在前人研究的基礎上對儀器條件適當優化，建立豬肉樣品中5 種呈味核苷酸的高效液相色譜檢測方法。選擇市場上4 款高端品牌豬肉的通脊肉和五花肉，確保其從屠宰后到取樣前僅冷藏運存，以常規烹飪方式熟制后分別分析熟肉和肉湯中5-鳥苷酸、5-肌苷酸、次黃嘌呤、5-腺苷酸和肌苷的含量差異，了解其對豬肉鮮味特征的影響，為評價市場上不同品牌豬肉鮮味核苷酸差異和消費者體驗提供理論參考。

1?? 材料與方法

1.1?? 材料與試劑

選取市場上2 款高端黑豬HZ1（北京盒馬超市）、HZ2（北京伊藤洋華堂）和2 款高端白豬BZ1、BZ2（北京物美超市）的通脊肉和五花肉產品，其中通脊肉為整條背最長肌，每款豬肉6 份，五花肉取自第5根和第7根肋骨間，每款豬肉4 份。

5-鳥苷酸二鈉、5-肌苷酸二鈉、5-腺苷酸、次黃嘌呤、肌苷?? 美國Sigma公司;高氯酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）?? 國藥集團化學試劑有限公司;濾膜（水系，0.45 μm）?? 天津科億隆實驗設備有限公司;中速定性濾紙?? 杭州特種紙業有限公司。

1.2?? 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀（配有SPD-M20A紫外檢測器）?? 美國Waters公司;Diamonsil Plus C₁₈-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）?? 北京迪科馬科技有限公司;ME 3002E分析天平、S210 pH計?? 瑞士Mettler-Toledo公司;5810R高速離心機?? 德國Eppendorf公司;KQ-250DE超聲儀?? 昆山市超聲儀器有限公司;HR-500均質機?? 上海滬析實業有限公司;FP3010絞肉機?? 德國Braun公司;C22電磁爐?? 浙江蘇泊爾股份有限公司。

1.3?? 方法

1.3.1?? 標準品處理

分別稱取5-鳥苷酸二鈉、5-肌苷酸二鈉、5-腺苷酸、次黃嘌呤、肌苷標準品溶解于水中，采用容量瓶定容，配制得到5 mg/mL 5-鳥苷酸、10 mg/mL 5-肌苷酸、2 mg/mL 5-腺苷酸、0.5 mg/mL次黃嘌呤、5 mg/mL肌苷單一標準品溶液。將上述溶液等體積混合后，再加入同等體積水，得到混合標準溶液。將混合標準溶液分別稀釋2、3、4、5 倍，過濾膜，采用高效液相色譜檢測。

1.3.2?? 樣品前處理

修整豬肉樣品（五花肉樣品去皮），切成3 cm×3 cm×3 cm小塊，均勻混樣，稱取500 g（精確至0.1 g），加入1 000 g純凈水，中火煮制1 h后加冷水至煮制前質量，放置，溫度降至室溫，撈出肉塊。將肉塊樣品絞碎，稱取10 g（精確至0.1 g）于50 mL離心管中，加入25 mL體積分數6%高氯酸，均質混勻，10 000 r/min離心10 min，上清液采用中性定性濾紙過濾，剩余沉淀重復提取，上清液同樣過濾，2次濾液采用5 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至5.4，加水定容至100 mL，搖勻，過濾膜，采用高效液相色譜檢測。肉湯樣品以10 000 r/min離心10 min取上清液，再次離心后上清液過濾膜，采用高效液相色譜檢測。

1.3.3 ?? 色譜條件

采用Diamonsil Plus C₁₈-A色譜柱，紫外檢測波長為254 nm，進樣量為10 μm，流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀（用8 g/100 mL磷酸氫二鉀調pH值至5.4），以0.8 mL/min等梯度洗脫，柱溫40 ℃。

1.3.4?? 含量計算

肉樣中核苷酸含量按（1）計算。

X₁=（ρ₁×V₁×M₁）/（m₁×m）????????? （1）

式中：X₁為肉樣中待測物含量/（g/kg）;ρ₁為樣品溶液中待測物質量濃度/（g/L）;V₁為樣品溶液體積/mL;M₁為生肉熟制后肉樣質量/g;m₁為用于提取的熟肉質量/g;m為生肉質量/g。

肉湯中核苷酸含量按（2）計算。

X₂=（ρ₂×m₂）/m（2）

式中：X₂為肉湯中待測物含量/（g/kg）;ρ₂為樣品溶液中待測物質量濃度/（g/L）;m₂為生肉熟制后湯樣質量/g;m為生肉質量/g。

1.4?? 數據處理

采用Microsoft Excel 2013軟件擬合數據，得到線性方程，通過2 次驗證，計算加標回收率范圍和精密度。采用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析，并采用Microsoft Excel 2013軟件作圖。

2?? 結果與分析

2.1?? 高效液相色譜法檢測豬肉中核苷酸方法的建立

2.1.1?? 線性關系、定量限和檢出限

按照優化后的前處理和儀器條件進樣檢測，以色譜圖峰面積對標準品質量濃度繪制標準曲線，擬合線性方程。由表1可知，除5-鳥苷酸和5-肌苷酸保留時間較近外，其他核苷酸間隔較遠，能較好地讀取峰面積，計算目標物含量。5 種核苷酸在線性范圍內呈現良好線性關系，相關系數（R²）均大于0.996。以3 倍信噪比確定檢出限，10 倍信噪比確定定量限。5-鳥苷酸、5-肌苷酸、次黃嘌呤、5-腺苷酸和肌苷的定量限分別為0.002、0.040、0.002、0.016、0.011 mg/L，檢出限分別為0.007、0.132、0.007、0.052、0.038 mg/L。

2.1.2?? 加標回收率和精密度

取熟制后絞碎樣品10 g，按表2加標量加入2 個水平的標準品溶液，由表2可知，5 種核苷酸加標回收率為89.74%～112.48%，相對標準偏差為0.63%～5.37%，表明該方法精密度良好，滿足要求，可用于熟制豬肉樣品的呈味核苷酸含量測定。混合標準品、提取溶劑、通脊肉樣品及加標通脊肉樣品色譜圖如表1所示。

2.2?? 不同豬肉樣品熟肉率

對比不同品牌豬肉產品熟肉率，由表3可知：2 款黑豬通脊肉產品熟肉率均高于2 款白豬;BZ1白豬五花肉產品熟肉率最高，為84.20%，高于2 款黑豬五花肉產品，另一款白豬產品相對最低。因熟肉率各不相同，后續對比核苷酸含量均基于生肉質量（約500 g）計算。

2.3?? 不同品牌豬通脊肉樣品中核苷酸比較分析

豬肉中5-肌苷酸含量高低可間接反映肉品食用風味的優劣^[16]，其降解產物和5-鳥苷酸、5-腺苷酸均不程度影響感官風味^[17]。由圖2可知，4 款豬通脊肉熟制后肉和湯中5-肌苷酸含量均明顯高于其他核苷酸含量，肌苷次之，5-鳥苷酸含量最低。不同品牌間，BZ1通脊肉和湯中5-肌苷酸含量均最高（0.826、1.339 g/kg），HZ1最低（0.521、0.682 g/kg），且2 款白豬通脊顯著高于黑豬（P<0.05）。對比分析5-肌苷酸降解產物肌苷與次黃嘌呤，不同品牌間，HZ1通脊肉中肌苷含量最高（0.356 g/kg），其他品牌間無顯著差異（P<0.05），而HZ2通脊肉湯中肌苷含量最高（0.583 g/kg），2 款黑豬通脊肉湯顯著高于白豬（P<0.05）。就次黃嘌呤而言，HZ1通脊肉和湯中含量最高（0.107、0.155 g/kg），均顯著高于其他品牌（P<0.05），且2 款白豬通脊肉均顯著低于黑豬，白豬煮制后通脊肉和湯中含量均無顯著差異。就5-腺苷酸而言，不同品牌間，BZ1通脊肉和湯中含量最高（0.073、0.087 g/kg），BZ2處于中等水平，黑豬與白豬的5-腺苷酸含量未見相關性趨勢。就5-鳥苷酸而言，不同品牌間，BZ2通脊肉和湯中含量均最高（0.019、0.024 g/kg），2 款白豬通脊湯中顯著高于黑豬（P<0.05）。上述結果表明，豬通脊肉中主要呈味核苷酸以5-肌苷酸為主，熟制后更多核苷酸存在于湯中。白豬通脊肉熟制后在鮮味呈味上更具優勢，且BZ1最優。

目前，以豬肉背最長肌為研究對象，對比不同品種核苷酸含量差異的研究較多。席斌等^[18]發現，地方品種甘肅黑豬的5-肌苷酸含量低于有外來品種基因的甘肅長白豬，肌苷和次黃嘌呤含量高于后者。葛倩倩等^[1]同樣發現，杜長大雜交豬中5-肌苷酸含量（2.092 g/kg）顯著高于北京黑豬（1.988 g/kg），肌苷含量顯著低于北京黑豬，次黃嘌呤含量無顯著差異。本研究中2 款白豬通脊5-肌苷酸總量（BZ1為2.165 g/kg，BZ2為2.011 g/kg）均顯著高于黑豬（HZ1為1.202 g/kg，HZ2為1.453 g/kg），且肌苷總量和次黃嘌呤總量顯著低于黑豬，不同品種間含量差異趨勢與上述研究結果一致，白豬5-肌苷酸含量差異不大，但本研究黑豬5-肌苷酸含量明顯偏低。有研究表明，定遠黑豬的5-肌苷酸和5-鳥苷酸含量均顯著高于瘦肉型豬肉^[19]。造成這些不同結果的原因可能與日糧^[1]、飼養方式^[20]和貯藏條件^[21-22]等差異有關，如日糧中蛋白質水平不同^[23]或添加黃酮類物質^[24]，均會導致畜禽肉中5-肌苷酸含量的顯著變化。畜禽肉解僵過程中，5-肌苷酸在5-核苷酸酶和核苷水解酶的作用下生成肌苷和次黃嘌呤^[6]，因此鮮豬肉5-肌苷酸含量越高，肌苷和次黃嘌呤含量會降低，熟制豬肉風味可能越好。瘦豬肉的風味物質以水溶性為主^[25]，煮制后一部分會溶解在湯中，楊平等^[26]也發現，豬肉湯中5-肌苷酸含量明顯高于其他核苷酸，本研究中2 款白豬肉湯中5 種呈味核苷酸含量趨勢與熟肉一致，但2 款黑豬湯與肉之間略有差別，表現為HZ2肉中肌苷含量高于HZ1，而湯中相反，這可能與其肌纖維差異導致的系水力不同有關^[27]。5-肌苷酸是畜禽肉中主要呈鮮物質，其他核苷酸含量較低或不呈鮮味，且5-肌苷酸與其他鮮味氨基酸具有協同作用，并對苦味和酸味具有緩沖作用^[28]，因此綜合分析，豬肉煮制后肉和湯的鮮味還需進一步研究，如采用鮮味強度評價并結合專業感官測試分析。

2.4?? 不同品牌豬五花肉樣品中核苷酸比較分析

五花肉肥瘦相間，脂肪含量高，其風味物質主要是脂質氧化及降解產生的醛類、酯類和醇類化合物等揮發性物質^[29]。目前對五花肉滋味尤其是鮮味成分研究較少。由圖3可知，4 款豬五花肉熟制后肉和湯中5-肌苷酸含量均明顯高于其他核苷酸含量，肌苷次之，5-鳥苷酸含量最低，與通脊肉一致，說明5-肌苷酸是豬肉中最主要的呈味核苷酸。不同品牌間，BZ1五花肉中5-肌苷酸含量最高（0.319 g/kg），BZ2五花肉湯中5-肌苷酸含量最高（0.493 g/kg），與BZ1五花肉湯無顯著差異，2 款白豬五花肉和湯均顯著高于黑豬（P<0.05）。對比通脊肉和五花肉5-肌苷酸含量發現，五花肉中含量遠低于通脊肉，表明核苷酸主要存在于肌肉組織。對比分析5-肌苷酸降解產物肌苷與次黃嘌呤，不同品牌間，HZ2五花肉中肌苷含量相對最高（0.120 g/kg），BZ2五花肉湯中最高（0.199 g/kg），黑豬與白豬的肌苷含量未見相關性趨勢。就次黃嘌呤而言，HZ2五花肉中含量最高（0.076 g/kg），顯著高于其他品牌（P<0.05）;HZ1五花肉湯中含量最高（0.115 g/kg），與HZ2無顯著差異，顯著高于白豬（P<0.05）。不同品牌間五花肉中5-腺苷酸含量無顯著差異（P<0.05），BZ2五花肉湯中最高（0.041 g/kg），其他品牌無顯著差異（P<0.05）;不同品牌間，HZ1五花肉和湯中5-鳥苷酸含量最低，顯著低于其他品牌，其他品牌間無顯著差異（P<0.05）。上述結果表明，在核苷酸占比、熟制后存在位置和鮮味呈味方面五花肉均與通脊肉一致，即白豬優于黑豬，且BZ1最佳。

目前針對五花肉的研究集中于其營養成分、揮發性風味物質和加工特性分析。針對脂肪含量較高的豬肉部位，其香氣特征更受關注。王蒙等^[30]以后腿肉為研究對象，發現肉湯中的風味物質由呈味氨基酸與多肽與還原糖發生美拉德反應和脂質降解氧化反應得到。Zhao Jian等^[31]對比發現，黑豬肉和白豬肉湯中香氣成分幾乎相同，但黑豬肉湯較白豬肉湯有更多的烤肉香味，因前者具有較多的單不飽和脂肪酸^[30]。王瑞花等^[32]利用迷糊數學綜合評價法優化獲得紅燒肉的最佳工藝，并成功分離鑒定出關鍵風味物質，結果顯示均與脂質相關。亦有研究發現，脂肪同樣能夠提供鮮味^[33]，脂肪味也可能對其他基本味覺產生影響^[34]，Iida等^[35]對比不同粗脂肪含量牛肉風味發現，一定程度內粗脂肪含量增多，鮮味增強，另外，多不飽和脂肪酸含量相對較高則可能使肉品風味變差^[36]。五花肉由于脂肪含量較高，其整體風味易受脂肪性質及其反應產物影響，僅對五花肉中呈味核苷酸進行研究并不能準確呈現其鮮味特征。五花肉作為人們最喜愛食用的部位之一，在本研究中5 種核苷酸水平與通脊熟肉和湯中基本一致，為綜合評價白條不同部位的感官特征提供了新依據。

3?? 結? 論

初步建立5 種呈味核苷酸的高效液相色譜檢測方法，該法線性關系良好、分析時間短（20 min內）、精密度高。利用該法檢測對比4 款高端品牌豬肉2 個部位（通脊和五花）的呈味核苷酸含量，發現豬肉中5-肌苷酸含量明顯高于其他核苷酸，五花肉中呈味核苷酸含量遠低于通脊肉，表明5-肌苷酸是豬肉中最主要的核苷酸，且主要存在于肌肉組織;白豬肉和湯中5-肌苷酸含量均顯著高于黑豬（P<0.05），肌苷與次黃嘌呤含量總體上低于黑豬，白豬BZ1通脊肉和BZ2五花肉湯中5-腺苷酸含量最高，白豬BZ2通脊肉中5-鳥苷酸含量最高，黑豬HZ1五花肉中5-鳥苷酸含量最低。綜上，無論通脊還是五花，白豬在鮮味呈現上比黑豬更具優勢，用于烹飪肉菜和湯品均更理想，白豬BZ1最佳，黑豬HZ1最差。豬肉中風味物質繁多，相互作用影響明顯，單一的鮮味成分并不能評判豬肉綜合品質，豬肉熟制后整體的口感風味還需結合其他呈味物質，如呈味氨基酸、揮發性風味物質等綜合分析。