高溫脅迫下葉用萵苣核體系酵母文庫構建與鑒定

李云峰，李振峰，杜 楊，韓瑩琰，劉超杰，郝敬虹

(北京農學院 植物科學技術學院/農業應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206)

葉用萵苣，俗稱生菜，菊科萵苣屬。根據聯合國糧食及農業組織的數據，2019 年全球生菜和菊苣的產量超過 2 900 萬噸，在所有葉類蔬菜中排名第三。生菜因其品種多樣、口味多樣、營養價值高、富含維生素、葉酸和礦物質而在全球廣受歡迎。生菜已成為研究菊科及相關植物的典范。但是葉用萵苣作為一種高溫敏感型葉用蔬菜，在高溫的脅迫下極易向生殖生長轉變[1]。當外界環境溫度超過30 ℃時，就會導致先期抽薹，造成生菜產量和食用價值的下降。

在外界環境條件以及植物自身遺傳因素的影響下,常常會導致花芽分化提前的現象,造成植物的先期抽薹[2]。宋有金等發現熱脅迫對開花有促進作用[3]。植物對高溫脅迫的響應是一個極其復雜過程,當外界溫度升高時,細胞膜上的脅迫感受器膜蛋白通過信號傳導途徑傳遞至細胞核，從而影響相關基因的表達[4]。由此可知,高溫脅迫應答信號可以引起高溫脅迫應答信號通過傳導神經途徑細胞中的多種抗體基因組的表達,參與抑制調控萵苣植物多種抗體的高溫脅迫應答[5],但是在應答調控過程中許多未知調控機制理論反應機制尚不清楚,挖掘和研究探討這些未知調控機制對深入研究葉用萵苣的抗高溫反應調控機制具有重要理論意義。

核體系酵母文庫的建立對研究蛋白間相互作用意義重大。李紫良通過酵母單雜試驗證明了TaTMS5是TaERF7的下游靶基因,得出高溫和長日照條件時,小麥中TaERF7基因表達量降低,同時對TaTMS5的抑制作用減弱結論[6]。原貴波等通過酵母雙雜交技術找到了SlMPK1的互作蛋白SlVQ6蛋白,并通過GST pull-down技術驗證SlMPK1與SlVQ6的互作,為研究SlVQ6介導的高溫應答信號通路奠定基礎[7]。Distelfeld等通過酵母三雜交試驗證明在植物中,VRN2與三種 NF-YB 蛋白中的兩種之間的相互作用[8]。由此可知,建立一個高質量的葉用萵苣核體系酵母文庫對探究高溫脅迫下葉用萵苣機制起到至關重要作用。

GB-30是作為高溫條件下極易抽薹品種，可作為模擬夏季高溫脅迫下生菜發生抽薹現象的代表品種，通過對其35 ℃高溫處理8 d后，取其莖尖以及葉片采用Geteway方法建立cDNA文庫，為后續探究高溫脅迫下葉用萵苣抽薹相關機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

GB-30葉用萵苣材料由北京農學院植物科學技術學院園藝學生菜課題組提供，試驗材料種植于人工氣候培養箱。生長條件可參照生菜最適溫度[9]。待幼苗長至6葉1心時對試驗材料進行高溫脅迫處理。高溫處理條件為：光強以及光照不變，溫度提升至白天33 ℃，晚上25 ℃。取8 d高溫處理的莖尖和新生葉片1 g等量混合，進行液氮速凍，并對其立刻進行RNA提取，此為高溫脅迫下GB-30生菜核體系酵母文庫構建試驗材料。

1.2 葉片總 RNA 提取與 mRNA分離純化

對高溫處理的樣品混樣，進行總RNA提取，采用CTAB法。接著對 mRNA進行分離純化(具體可參考Oligotex mRNA Midi Kit說明書)。總RNA用DEPC水溶解至體積為500μL；500 μL buffer OBB和55 μL Oligotex suspension；70 ℃，5 min；25 ℃，30 min；12 000 r/min,2 min；去除上清;加入400 μL 洗脫液(OW2)；混勻后轉到吸附柱,12 000 r/min,1 min；重復1次；加入70 μL buffer OEB (70 ℃)；12 000 r/min,1min；重復mRNA。向分離后的mRNA加入NH4OAC，無水乙醇以及糖原，-80 ℃,25 min；4 ℃，13 000 r/min,20 min；加1 mL 70%乙醇25 ℃，離心，去除上清；空氣中晾干，7 μL水，即為純化后的mRNA。

1.3 葉用萵苣酵母雙雜交初級cDNA文庫構建

1.3.1 cDNA第一鏈的合成 取適量純化后mRNA，按照試劑盒加入biotin-attB2-Oligo(dT) Primer 1 μL,dNTPs 1 μL，70 ℃ 5 min，45 ℃ 2 min。之后加5×First Strand Buffer，4 μL；DTT(0.1 M)2 μL；SuperScript III RT 適量,45 ℃ 20 min；50 ℃ 20 min；55 ℃ 20 min。

1.3.2 cDNA第二鏈的合成 在上述反應液中加入DEPC-treated water 91 μL,5 X Second Strand Buffer,30 μL,10 mM(each)dNTPs 3 μL,E.coli.DNA Ligase(10 U/μL) 1 μL,E.coli.DNA Polymerase I(10 U/μL) 4 μL,E.coli.RNaseH(2 U/μL) 1 μL, 補水至150 μL。16 ℃，2 h； 加入T4 DNA Polymerase 2 μL，16 ℃，10 min；加入0.5 M EDTA (pH=8.0)10 μL，補水至300 μL；加入酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1) 300 μL，混勻，靜置1 min；14 000 r/min離心5 min，取上清液于新的離心管中，加入Glycogen (20 μg/μL) 1 μL，5 M 醋酸胺150 μL,100% ethano,1 125 μL，-80 ℃，15 min；14 000 r/min，4 ℃，25 min；去上清；加入1 mL 70%乙醇；14 000 r/min，4 ℃，離心3 min，去上清；重復1次； 室溫25 ℃晾干cDNA；用104 μL DEPC溶解cDNA。

1.3.3 cDNA與三框attB1重組接頭連接(3種接頭分別各連接1份) 先將attB1 Adapter (1 μg/μL) F，4.5 μL，attB1 Adapter (1 μg/μL) R 4.5 μL，10×NEB Buffer 2 1 μL，95 ℃，5 min, 25 ℃，45 min。加入cDNA 34 μL，10×Ligation Buffer 5 μL，T4 DNA Ligase(1 U/μL) NEB 1 μL，16 ℃，24 h。

1.3.4 cDNA分級分離及收集 向分級柱中加入0.8 mLTEN Buffer清洗柱子，重復3次；將上訴制備好的3份50 μL的cDNA產物混勻加入柱子中，TEN Buffer 100 μL，收集濾液，向其中加入Glycogen (20 μg/μL) 1 μL, NH4OAc 0.5 μL，100% ethanol 2.5 μL，-80 ℃，15 min；14 000 r/min，4 ℃，25 min，去上清；70%乙醇 1 mL；14 000 r/min，4 ℃，3 min；去上清；重復1次；室溫5 min ；DEPC 13 μL溶解cDNA，即cDNA分級分離及收集。

1.3.5 BP重組反應 取cDNA 13 μL,加入pDONR222(200 ng/μL)2 μL,BP Clonase? II enzyme mix 5 μL,補水至20 μL,25 ℃,20 h。在上述溶液中加入dd-water 80 μL,Glycogen (20 μg/μL)1 μL,5 M NH4OAc 50 μL,100% ethanol 375 μL,-80 ℃,15 min；13 000 r/min,4 ℃,25 min,去上清;70%乙醇1 mL,14 000 r/min,4 ℃,3 min，去上清；重復1次,室溫晾干cDNA；TE Buffer 10 μL溶解cDNA；加入50 μL電轉感受態細胞,冰上10 min,加入電轉杯,冰上5 min;迅速加入SOC培養基4 mL;將電轉物取入到新的15 mL離心管,37 ℃,2 250 r/min,1 h;之后涂布平板用于庫容量鑒定;剩余培養物加入甘油至終濃度20%存于-80 ℃,此即為初級文庫菌液。

1.4 高溫脅迫下GB-30葉用萵苣酵母雙雜交次級cDNA文庫構建

將驗證合格的Uncut文庫,搖菌,30 ℃過夜培養,提取質粒建立LR重組反應:Uncut 文庫質(300 ng/uL)1 μL, pGADT7-DEST (300 ng/μL)1 μL,LR Clonase II Mix 4 μL,ddH2O 14 μL,25 ℃,16 h。電轉化大腸桿菌DH10B,同初級cDNA文庫構建步驟一樣,得到的即為次級文庫菌液。

1.5 cDNA文庫(Uncut型)文庫質量鑒定

1.5.1 初級及次級文庫庫容量的鑒定 取轉化后細菌原液10 μL稀釋100倍后,從中取出50 μL涂布LB平板(初級文庫抗性卡那霉素,次級文庫抗性為氨芐青霉素),第2天計數。計數方法:CFU/mL=平板上的克隆數/50 μL ×100倍×1×103μL,文庫總CFU= CFU/mL ×文庫菌液總體積(mL)。

1.5.2 重組率和插入片段長度鑒定 隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，反應體系為dd H2O 16.2 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，pDONR222F(20 μM)0.5 μL，pDONR222R(20 μM)0.5 μL，DNA Polymerase(5 U/μL)0.3 μL。PCR反應條件為94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；25循環，72 ℃ 5 min。1 % Agarose凝膠電泳鑒定。

1.5.3 酵母文庫質量鑒定 用5 μg作為酵母文庫質粒中的一個轉化子和Y187酵母質粒轉化菌株,在每個直徑為150 mm的平板上均勻橫向鋪展300 μL,共計100塊平板。30 ℃倒置溫育平板，從當天開始起一直到每個細胞克隆后的結果開始出現(3～6 d),4 ℃需要冷卻倒置平板3～4 h,每個倒置平板每天需要連續加入5 mL已經冷凍后的細胞培養基,混勻,匯集所有細胞中的液體,計算每個細胞的密度,確定文庫滴度。在溫育平鋪100 μL按照1∶100,1∶1 000,1∶10 000稀釋液在酵母缺陷型培養基(SD-Leu)平板上,在30 ℃條件下，倒置溫育平板直到每個細胞克隆結果開始出現。挑克隆,30 ℃,250 r/min,12 h；10 000 r/min,2 min,去上清。0.2% SDS,200 μL重懸菌液,25 ℃,15 min,離心；取1 μL上清液作為PCR模板,依次加入ddH2O 19.5 μL,10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL,50×dNTP Mix 0.5 μL,T7SP Primer 0.5 μL,3′ AD Primer 0.5 μL,50×Advantage 2 Polymerase Mix 0.5 μL,94 ℃,3 min,94 ℃，30 sec,55 ℃ 30 sec,72 ℃，2 min,35個循環,72 ℃ 5 min。PCR產物取5 μL用于電泳檢測。

2 結論與分析

2.1 葉用萵苣mRNA與ds cDNA質量檢測

mRNA結果顯示條帶在500～2 000 bp的范圍內呈均勻性的彌散彈性分布,證明有效cDNA文庫mRNA條帶質量保持較好,未發生化學降解。ds cDNA條帶在較大長度范圍內結構呈彌散性均勻縱向分布,因此得出其cDNA條帶結構完整性較好,質量性能較高,可用于構建高溫脅迫下GB-30葉用萵苣酵母雙雜交cDNA文庫。

2.2 初級cDNA文庫構建與鑒定

經生物學重復計算GB-30葉用萵苣核體系cDNA酵母文庫平板上共長出1700個有效克隆,得到的初級cDNA文庫平板滴度大約1.36×107cfu/mL。隨機重組選取的4個插入克隆進行PCR檢測,24個插入克隆結果顯示均超出克隆條帶,重組成功率平均為100%,該檢測結果從一定很大程度上有效降低了該克隆假說的陽性。24個插入克隆全部擴增為5 00 bp以上,且每個插入克隆片段平均插入長度最大>1 000 bp(圖1)。由此可 知,以上分析數據已經達到用于構建高溫脅迫下GB-30葉用萵苣cDNA數據文庫的標準。

圖1 初級文庫重組率鑒定Fig.1 Identification of recombination rate of Primary Library

2.3 核體系次級文庫鑒定

經分析計算GB-30葉用萵苣次級酵母cDNA文庫平板上共長出1300個單克隆,次級酵母cDNA用的文庫平板滴度大約為1.04×107cfu/mL。從次級cDNA等文庫克隆培養基中隨機選擇的24個新型克隆經過PCR等檢測,凝膠電泳克隆圖譜中的條帶結果顯示24個新型克隆全部經過擴增后均有條帶,重組成功率平均為100%且克隆插入每個片段平均時間長度>1 000 bp(圖2)。由此可知,以上統計數據已經達到如何構建能在高溫環境脅迫下GB-30葉用綠葉萵苣作為酵母雙雜交的cDNA文庫的標準。

圖2 插入片段大小及重組率鑒定Fig.2 Identification of insert fragment size and recombination rate

2.4 cDNA文庫質量鑒定

該cDNA酵母文庫平板上共產出1 000個核體系克隆子,文庫平板滴度平均為1.0×108cells/mL。利用PCR來檢測葉用萵苣桿菌cDNA體系酵母化學文庫平板重組率與克隆插入每個片段平均長度,在本試驗的核體系酵母cDNA文庫平板培養基中隨機選擇24個核體克隆進行檢測。根據凝膠電泳克隆圖譜儀的檢測數據結果顯示,24個核體克隆全部經過擴增后均有條帶,重組的效率平均為100%,且克隆插入每個片段平均插入長度為> 1 000 bp(圖3)。由此可知,以上檢測數據已經達到了對構建細胞高溫層的脅迫下GB-30葉用萵苣核體系酵母cDNA文庫標準。

圖3 酵母克隆鑒定Fig.3 Yeast cloning and identification

3 討論與結論

高質量的cDNA文庫是篩選蛋白互作的前提。核體系酵母文庫的質量主要是通過文庫的庫容量判定。對于一個含有104個轉錄本的物種來說，106庫容的cDNA文庫是對該物種所有的轉錄本的100倍覆蓋。本試驗初級文庫的庫容量為1.36×107，次級文庫的庫容量為1.04×107，由此可知本試驗構建的核體系酵母文庫已達到質量標準。王玉姣, 陳姍姍等構建的cDNA文庫庫容量為1.13×106[10]；許向陽等人構建的干旱脅迫下‘Micro-Tom’番茄酵母雙雜交cDNA文庫庫容量為3.4×106[11],相比本試驗構建的cDNA文庫基因信息更全面。cDNA文庫質量是否達到標準的另一個鑒定方法是插入片段及重組率。本試驗初級、次級文庫的插入片段平均長度均>1 000 bp，重組率為100%，是達到文庫質量標準要求的。許向陽等構建的文庫插入片段平均長度皆為 1 000 bp,重組率是100%[11]，與本試驗結果一致；劉露露等構建的文庫插入片段平均長度皆為 1 000 bp,重組率是96%[12]。由此可見本試驗構建的核體系酵母cDNA文庫假陽性更低，質量更符合標準。

核體系酵母文庫非常適用于一個誘餌內的基因直接定位保存在一個核細胞系統內的各類蛋白。已知一個誘餌內的基因定位有一些跨細胞膜內的區，也那么可以直接考慮把這些跨細胞膜內的區基因切除以后直接用來找核系統體系酵母文庫蛋白篩庫[13]。酵母雙雜交結合技術目前作為一項較成熟的生物技術，已可用于藥物臨床試驗研究多種抗原單體蛋白質間相互作用,具有同時不斷發現新的多種抗原單體蛋白質和其他抗原蛋白質的相互作用功能、在一個抗原細胞體內同時發現研究多種單體抗原和其他多種抗體的相互作用、篩選多種抗原藥物的相互作用源和對應位點、建立多個抗原基因分子組織與抗原蛋白質的相互連鎖作用光譜結構圖等重要技術功能,其應用也會越來越重要[14]。劉愛麗在進行研究一種熱激肽肽反應酶與相關分子剪接蛋白因子的互補操作剪接蛋白時通過雙雜交剪接技術,從擬南芥cDNA文庫中共篩選到了43個單克隆體,通過驗證最終確定18個待選基因與目的基因在體外相互作用。而大部分基因在植物體內與目的基因也是相互作用的[15]。

本試驗以高溫脅迫GB-30葉用萵苣莖尖及葉片混合物為材料，通過Geteway技術構建核體系酵母cDNA文庫。結果表明：構建的核體系酵母文庫已達質量標準，總克隆數 1.36×107CFU/mL，重組率為 100%，平均插入片段長度>1 000 bp。