體外評估乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7免疫調節作用的影響

葉望娟，周佳豪，劉成國，羅 潔，張 鋒，唐 霞，周 輝*

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.皇氏集團湖南優氏乳業有限公司，湖南 長沙 410205）

巨噬細胞是由外周血單核細胞分化而來的重要的免疫效應細胞，其在先天和獲得性免疫應答中發揮關鍵作用，可以通過吞噬、細胞毒性和細胞內防御能力識別和消除病原體[1-3]。巨噬細胞既分泌促炎細胞因子（腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6），又分泌抗炎細胞因子（轉化生長因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）和IL-10），在免疫應答過程中扮演多種角色[4-7]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指一類能在可利用的碳水化合物發酵過程中產生乳酸的細菌[8]。現已發現乳酸菌具有多種益生特性，如免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇等[9-11]。有研究表明，乳酸菌能通過誘導增強單核細胞和巨噬細胞的活性、提高活性氧、活性氮含量和吞噬能力，也能通過巨噬細胞抗原加工并遞呈至T、B淋巴細胞，引起體液免疫和細胞免疫，從而調節機體的非特異性和特異性免疫功能[12-14]。BISWARANJAN P等[15]研究發現，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）MTCC-10307和克勞斯芽孢桿菌（Bacillus clausii）MTCC-8326在調節小鼠巨噬細胞的天然免疫反應和保護細胞免受鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）誘導的細胞毒性方面表現出顯著的作用；蒙月月等[16]通過小鼠脾淋巴細胞和巨噬細胞體外評估10株乳桿菌對免疫細胞活性的影響，結果表明植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）KLDS 1.0318具有較高的免疫調節活性。然而，不同的益生菌菌株調節免疫細胞的能力不同[17-19]。

因此，本研究以商業菌株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）LGG為陽性對照菌株，體外評估本實驗室保藏的5株乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7細胞活性、吞噬活性以及炎癥因子釋放水平的影響，篩選具有良好免疫調節作用的乳桿菌，以期為后續研究提供數據支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與細胞

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）12E、植物乳桿菌（L.plantarum）15E、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）24E、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）260、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）83：由湖南農業大學食品科技學院乳品加工實驗室分離保存；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamno sus）LGG（ATCC53103）：本實驗室保存；巨噬細胞RAW264.7（ATCC TIB-71）：長沙隆和化玻實驗用品有限公司。

1.1.2 試劑

TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：廈門侖昌碩生物科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒：美國Promega公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美國Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶溶液：以色列貝特哈梅克生物工業公司；超高靈敏細胞增殖CCK-8試劑盒：上海尚寶生物科技有限公司;乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；杜氏改良Eagle培養基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）：以色列貝特哈梅克生物工業公司。

1.2 儀器與設備

GZ-400-S恒溫培養箱：韶關市廣智科技設備有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺：蘇州凈化限公司；BKQ-B50II全自動高壓蒸汽滅菌鍋：山東博科科學儀器有限公司；HH-601超級恒溫水浴鍋：常州市萬豐儀器制造有限公司；HR/T16M臺式高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；HF90二氧化碳培養箱：力康生物醫療科技控股有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌菌懸液的制備

將甘油管中保存的受試菌株及商業菌株鼠李糖乳桿菌LGG（陽性對照菌）接種于1 mL MRS肉湯培養基中，37 ℃恒溫培養24 h，活化2代。將活化2代后的菌株接種至5 mL MRS肉湯培養基中，菌體濃度為106CFU/mL，37 ℃恒溫靜置培養24 h，發酵液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心2 min，棄上清，將菌體沉淀用無菌生理鹽水洗滌兩次后于含10%胎牛血清的DMEM培養基中重懸，調整菌體濃度為1×108CFU/mL，備用。

1.3.2 巨噬細胞RAW264.7的培養

將細胞復蘇后，置于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養；當細胞長至80%～90%融合時，采用磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2～3次，加入1 mL胰蛋白酶溶液進行消化，加入1 mL DMEM培養基終止消化；消化液于800 r/min條件下離心5 min，棄掉上清液，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞后分裝，每瓶1 mL；每瓶加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃、5%CO2條件下傳代培養，傳至3～4代時，800 r/min離心5 min，棄掉上清液，重懸細胞；使用血球計數板計數，用含10%胎牛血清的DMEM培養基調整細胞濃度為1×106個/mL備用[20]。

1.3.3 巨噬細胞RAW264.7細胞活性的測定

巨噬細胞RAW264.7的處理：參考文獻[21-22]稍作修改。將巨噬細胞RAW264.7接種于96孔板，每孔細胞懸液（細胞濃度為1×104個/mL）100 μL。37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，細胞貼壁生長，棄培養液。設空白調零組（加100 μL含10%胎牛血清的DMEM培養基于空白孔中）、乳酸菌調零組（加菌體濃度分別為1×104CFU/mL、1×105CFU/mL和1×106CFU/mL菌懸液100 μL于空白孔中）、陰性對照組（加100 μL含10%胎牛血清的DMEM培養基于細胞貼壁孔中）、陽性對照組（加100 μL含1 μg/mL LPS、10%胎牛血清的DMEM培養基于細胞貼壁孔中）和實驗組（分別加100 μL菌體濃度為1×104CFU/mL、1×105CFU/mL和1×106CFU/mL的菌懸液于細胞貼壁孔中，即使不同乳酸菌菌體濃度與初始細胞濃度以1∶1、10∶1、100∶1的比例共培養），每組6個副孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養12 h。

巨噬細胞RAW264.7細胞增殖率的測定：采用超高靈敏細胞增殖CCK-8試劑盒測定細胞增殖率，向每孔中加入CCK-8溶液10 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養4 h；充分混勻后用酶標儀測定其在波長490 nm處的光密度值（optical density，OD490nm），并計算巨噬細胞RAW264.7的細胞增殖率，其計算公式如下：

式中：OD1為陰性對照組的OD490nm值；OD2為乳酸菌調零組的OD490nm值；OD3為實驗組的OD490nm值；OD4為空白調零組的OD490nm值。

乳酸脫氫酶活性的測定：采用LDH活性檢測試劑盒測定培養上清液的LDH活性，反應細胞膜的完整性。

1.3.4 巨噬細胞RAW264.7吞噬活性測定

參考占萌[20]的方法稍作修改。設陰性對照組、陽性對照組和實驗組，按方法1.3.3處理巨噬細胞RAW264.7，培養12 h后，加0.072%中性紅液100 μL/孔，繼續培養30 min后棄去中性紅，PBS洗滌2次，每孔加入細胞裂解液（乙醇∶乙酸=1∶1，V/V）100 μL，放置4 ℃冰箱過夜，細胞完全溶解后，采用酶標儀測定波長540 nm處的光密度值，計算吞噬活性，其計算公式如下：

式中：OD1為陰性對照組的OD540nm值；OD2為實驗組的OD540nm值。

1.3.5 巨噬細胞RAW264.7分泌NO、IL-10和TNF-α能力的測定

將巨噬細胞RAW264.7接種于24孔板，每孔細胞懸液（細胞濃度為5×105個/mL）1 mL，37 ℃、5%CO2條件下培養18 h，細胞貼壁生長，棄培養液，設陰性對照組（加1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基于細胞貼壁孔中）、陽性對照組（加1 mL含1 μg/mL LPS、10%胎牛血清的DMEM培養基于細胞貼壁孔中）和實驗組（分別加1 mL菌體濃度為5×105CFU/mL、5×106CFU/mL和5×107CFU/mL菌懸液于細胞貼壁孔中，即使不同乳酸菌菌體濃度與初始細胞濃度以1∶1、10∶1、100∶1的比例共培養），每組4個副孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。培養液于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，收集細胞上清液，采用試劑盒測定共培養上清液中NO、IL-10和TNF-α的含量。

1.3.6 數據處理

利用Excel 2010軟件進行數據整理及統計分析，以SPSS Statistics 21.0進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）；使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7細胞活性的影響

2.1.1 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響

由圖1可知，與陰性對照組相比，陽性對照組巨噬細胞RAW264.7的增殖率[（163.24±4.28）%]顯著升高（P＜0.05）；不同乳桿菌均可在一定程度上誘導巨噬細胞RAW264.7的體外增殖，但對細胞刺激增殖能力表現出菌株差異性，不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7的增殖率范圍為82%～253%。與陰性對照組相比，當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為1∶1時，干酪乳桿菌83能顯著促進巨噬細胞RAW264.7的增殖（P＜0.05），細胞增殖率為（165.98±5.03）%；當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為10∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260及鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著促進巨噬細胞RAW264.7的增殖（P＜0.05），細胞增殖率分別為（161.41±18.14）%、（160.92±22.99）%、（204.47±32.96）%；當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為100∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260、植物乳桿菌12E及鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著促進巨噬細胞RAW264.7的增殖（P＜0.05），其中，鼠李糖乳桿菌LGG對巨噬細胞RAW264.7的增殖效果最好，細胞增殖率為（253.20±30.00）%，其次為鼠李糖乳桿菌260，細胞增殖率為（196.62±14.76）%。與陽性對照組相比，僅有鼠李糖乳桿菌LGG菌體濃度與初始細胞濃度為100∶1時，細胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。

圖1 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響Fig.1 Effect of different Lactobacillus on the proliferation of macrophages RAW264.7

2.1.2 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7乳酸脫氫酶釋放量的影響

由圖2可知，與陰性對照組相比，陽性對照組能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量（P＜0.05），LDH釋放量為（854.72±2.57）U/100 mL；不同乳桿菌均可在一定程度上抑制巨噬細胞RAW264.7釋放LDH，不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量范圍為554～1 084 U/100 mL。與陰性對照組相比，當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為1∶1時，鼠李糖乳桿菌260和鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量（P＜0.05），LDH釋放量分別為（829.89±8.67）U/100 mL、（865.33±9.90）U/100 mL；當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為10∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260和鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量（P＜0.05），其中鼠李糖乳桿菌LGG降低效果最好，LDH釋放量為（832.78±27.71）U/100 mL，其次為鼠李糖乳桿菌260，LDH釋放量為（829.70±10.41）U/100 mL；當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為100∶1時，除短乳桿菌24E外，其余菌株均能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量（P＜0.05），其中鼠李糖乳桿菌260降低效果最好，LDH釋放量為（554.36±6.74）U/100 mL，其次為植物乳桿菌15E，LDH釋放量為（765.13±8.62）U/100 mL。短乳桿菌24E和在低濃度情況下的干酪乳桿菌83、植物乳桿菌12E與巨噬細胞RAW264.7共培養后，LDH釋放量均有不同程度的升高，分析原因可能是乳桿菌使巨噬細胞RAW264.7的細胞膜損傷，LDH大量釋放至胞外[23-25]。與陽性對照組相比，僅有鼠李糖乳桿菌260菌體濃度與初始細胞濃度為100∶1時，巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量顯著降低（P＜0.05）。

圖2 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7乳酸脫氫酶釋放量的影響Fig.2 Effect of different Lactobacillus on the release amount of lactate dehydrogenase from macrophages RAW264.7

2.2 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7吞噬活性的影響

由圖3可知，與陰性對照組相比，陽性對照組巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性顯著提高（P＜0.05），吞噬活性為（134.12±1.52）%；不同乳桿菌均可在一定程度上提高巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性，且具有劑量依賴性，隨著乳桿菌活菌數的增加，巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性也隨之增大，吞噬活性在105%～184%范圍內。與陰性對照組相比，當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為10∶1時，鼠李糖乳桿菌260及鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性（P＜0.05），吞噬活性分別為（128.78±3.19）%、（183.79±20.63）%；當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為100∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260、植物乳桿菌12E及鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性（P＜0.05），其中，鼠李糖乳桿菌LGG對提高巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性效果最好，吞噬活性為（158.50±24.74）%，其次為鼠李糖乳桿菌260，吞噬活性為（136.86%±7.82）U/100 mL。與陽性對照組相比，僅有鼠李糖乳桿菌LGG菌體濃度與初始細胞濃度分別為10∶1和100∶1時，吞噬活性顯著提高（P＜0.05）。

圖3 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7吞噬活性的影響Fig.3 Effect of different Lactobacillus on the phagocytic activity of macrophages RAW264.7

2.3 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7分泌NO水平的影響

由圖4可知，與陰性對照組相比，陽性對照組巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量顯著提高（P＜0.05），NO分泌量為（28.39±1.05）μmol/L；不同乳桿菌均能在一定程度上提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量，但作用效果均顯著低于陽性對照組（P＜0.05），且有明顯的菌株依賴性，NO分泌量在2.07～14.65 μmol/L范圍內。與陰性對照組相比，當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為1∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260和鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量（P＜0.05），其中鼠李糖乳桿菌LGG效果最好，NO分泌量為（14.65±0.27）μmol/L；當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為10∶1時，干酪乳桿菌83、植物乳桿菌12E和植物乳桿菌15E均能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量（P＜0.05），其中干酪乳桿菌83效果最好，NO分泌量為（16.22±0.87）μmol/L；當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為100∶1時，僅有短乳桿菌24E能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量（P＜0.05），NO分泌量為（5.88±0.82）μmol/L。

圖4 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7分泌NO水平的影響Fig.4 Effect of different Lactobacillus on the NO secretion level of macrophages RAW264.7

2.4 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7分泌IL-10和TNF-α水平的影響

由圖5可知，與陰性對照組相比，陽性對照組巨噬細胞RAW264.7的IL-10、TNF-α分泌量均顯著提高（P＜0.05），分別為（11.85±0.22）pg/mL、（80.25±1.64）pg/mL。不同乳桿菌均能在一定程度上提高巨噬細胞RAW264.7的IL-10、TNF-α分泌量水平，作用效果有明顯的菌株依賴性，且部分菌株在特定濃度下的作用效果高于陽性對照組，IL-10、TNF-α分泌量分別在7.08～18.34 pg/mL、32.38～62.38 pg/mL范圍內。其中，植物乳桿菌12E對提高巨噬細胞RAW264.7的IL-10分泌量的作用效果最好，當乳桿菌活菌數與初始細胞的比例為1∶1時，IL-10分泌量最高為（18.34±0.55）pg/mL；干酪乳桿菌83對提高巨噬細胞RAW264.7的TNF-α分泌量的作用效果最好，當乳桿菌活菌數與初始細胞濃度的比例為100∶1時，TNF-α分泌量最高為（63.37±1.2）pg/mL，在此濃度下，兩菌株的作用效果均顯著高于陽性對照組（P＜0.05）。此外，鼠李糖乳桿菌260、鼠李糖乳桿菌LGG、植物乳桿菌12E和植物乳桿菌15E均能同時促進IL-10和TNF-α的分泌，更有利于維持免疫平衡。

圖5 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7分泌IL-10（a）及TNF-α（b）水平的影響Fig.5 Effect of different Lactobacillus on the IL-10 (a) and TNF-α (b)secretion level of macrophages RAW264.7

3 結論

本研究通過研究不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7細胞活性、吞噬活性以及NO、IL-10和TNF-α分泌水平的影響發現，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260和鼠李糖乳桿菌LGG在高濃度情況下能顯著提高巨噬細胞RAW264.7細胞增殖和吞噬活性以及維持細胞膜完整性（P＜0.05）；所有乳桿菌在特定濃度下均能提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量；鼠李糖乳桿菌260、鼠李糖乳桿菌LGG、植物乳桿菌12E和植物乳桿菌15E在各濃度情況下均能促進IL-10和TNF-α的分泌。綜合而言，鼠李糖乳桿菌260具有更優的免疫調節潛力。