伊枯草菌素A高產菌株的篩選鑒定及發酵工藝研究

曹小潔，萬銀平，趙長樂，張慧莉

（石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832003）

目前，我國對病原真菌的防治主要是化學農藥[1-2]，但使用化學農藥容易造成環境污染，所以需要尋找一種對環境安全且防治效果顯著的替代品[3]。芽孢桿菌（Bacillus）生長過程中，能夠合成脂肽類抗生素[4]、細菌素[5]和抑菌蛋白[6]等，其中，脂肽類抗生素主要有伊枯草菌素（iturin）[7]、芬芥素（fengycin）[8]和表面活性素（surfactin）[9]等，其對于常見的植物病原真菌具有良好的抑菌活性，可作為傳統化學農藥的替代品[10-11]。

iturins家族的化合物對許多具有致病性的酵母菌和霉菌有強烈抑制能力。Iturin A是一種β-氨基脂肪酸連成環的脂肽類抗生素，屬于iturin家族，其具有抑制某些病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumsp.）[12]、炭疽病菌（Colletotrichumspp.）[13]和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）[14]等生長的特性，在生物防治上具有潛在的開發價值。陳華等[15]采用電噴霧電離-質譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）法鑒定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）JA產生的抗菌物質為脂肽類抗生素iturin A，其對植物病原菌具有抗性作用；劉京蘭等[16-17]研究發現，一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）不僅對水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）具有強烈的抑制作用，還對小麥赤霉病和小麥白粉病等植物病害也具有防治作用，鑒定其產生的抗真菌活性物質主要也是iturin A。

iturin A及其同系物的發酵工藝控制難度大，制約著工業化生產和商業化應用[18]，因此，高產菌株的選育和優良的培養基成分對iturin A產量的提高具有重大意義[19-20]。本研究首先以大麗輪枝菌V991為病原指示菌，采用平板對峙法初篩獲得具有抗菌能力的菌株，然后通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法定量篩選獲得iturin A高產菌株，并對其16S rDNA基因序列進行分析，鑒定其種屬。最后對菌株產iturin A發酵培養基的成分和條件進行研究，為工業化發酵產iturin A、廉價發酵原料的利用和生防菌劑的開發提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

菌株Y1、Y2、Y3、Y4、Y6、Y7、SF5、ND：分離自石河子土壤中，保存于石河子大學生命科學412實驗室；大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）V991：石河子大學生命科學學院101實驗室提供。

1.1.2 培養基

LB固體培養基：NaCl 10 g/L、酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、瓊脂18 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。LB液體培養基中不添加瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：將馬鈴薯200 g切塊后煮沸20 min，濾液定容至1 L，添加葡萄糖20 g，瓊脂18 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。PDA液體培養基中不添加瓊脂。

初始Landy發酵培養基[21]：葡萄糖20 g/L、L-谷氨酸鈉2 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO41.0 g/L、KCl 0.5 g/L，微量元素：FeSO4·7H2O 0.15 mg/L、MnSO4·H2O 5 mg/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

iturin A標準品（分析純）：美國Sigma公司；葡萄糖（分析純）：天津市致遠化學有限公司；甘油（分析純）：天津市北聯精細化工有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；液體樣本甘油酶法測定試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司。

1.2 儀器與設備

安捷倫1200高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；ZHWY-111B恒溫培養振蕩器（搖床）：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DNP-9052電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；BWS-10恒溫水槽與水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；XEVO TQ-S三重四級桿串聯質譜儀、X3R高速冷凍離心機Fro Fle X聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 拮抗菌株的初篩

指示菌的制備：將大麗輪枝菌V991接種于PDA液體培養基，28℃、200r/min條件下恒溫振蕩培養2 d，無菌紗布過濾除去病原菌菌絲，將濾液孢子濃度稀釋至106～107CFU/mL，備用。

供試菌株的活化：將供試菌株Y1、Y2、Y3、Y4、Y6、Y7、SF5和ND接種于LB培養基平板，37 ℃活化16 h，備用。

抑菌活性的測定：取200 μL大麗輪枝菌V991孢子懸液均勻涂布于PDA培養基平板上，分別挑取單菌落接種于平板中，每板接種4株待測菌株。記錄是否有抑菌圈的產生，并測定抑菌圈直徑。

1.3.2 高產iturin A菌株的篩選

將初篩得到的拮抗菌株的單菌落分別接種于含有30mL的LB液體培養基中，在37 ℃、200 r/min條件下培養18 h制成種子液。按10%（V/V）的接種量將種子液轉接至含有30 mL的初始Landy發酵培養基，在32 ℃、200 r/min條件下發酵4 d。取發酵液1 mL，加入3 mL無水甲醇，漩渦振蕩10 min，10 000 r/min離心15 min后取上清[22]，采用HPLC法測定發酵液中iturin A的含量[23]，篩選高產iturin A的菌株。

1.3.3 高產iturin A菌株的鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取高產iturin A菌株的基因組總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[24]，以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）對菌株的16S rDNA進行PCR擴增，PCR擴增體系：DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，引物27F（5 μmol/L）1 μL，1492R（5 μmol/L）1 μL，雙蒸水（ddH2O）12 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸75 s，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經過1%瓊脂糖凝膠電檢測，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 菌株產iturin A發酵工藝的研究

發酵培養基成分的優化：額外添加NaCl[25]和酵母浸粉[16]有可能會提升iturin A的產量，因此在初始Landy發酵培養基的基礎上，依次考察碳源種類（葡萄糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉、D-木糖、甘露醇、甘油和蔗糖）（添加量2%）、氮源種類（大豆蛋白胨、花生餅粉、生黃豆粉、豆粕粉、玉米蛋白粉和棉籽粉）（添加量8%）、碳源添加量（2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%）、氮源添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、NaCl添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、酵母浸粉添加量（1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%）、KCl添加量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）及L-谷氨酸鈉添加量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）對菌株發酵產iturin A的影響。初始發酵條件為初始pH值6，32 ℃、200 r/min條件下發酵4 d。

發酵條件的優化：采用優化后的培養基，考察裝液量（12%、16%、20%、24%）、初始pH值（6.0、7.0、8.0、9.0）、接種量（3%、5%、10%、15%）、培養溫度（25 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃、40 ℃）對菌株產iturin A的影響。

最佳發酵時間的確定：高產菌株在最適的培養基成分和培養條件下生產iturin A，每24 h取樣檢測發酵液中pH、iturin A含量和甘油殘余量，確定最佳發酵時間。

1.3.5 數據處理

所有試驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示，采用MicrosoftExcel2010、Origin2018進行數據處理、分析及繪圖。

2 結果和分析

2.1 高產iturin A菌株的篩選

2.1.1 拮抗菌株的初篩

8株供試菌株對大麗輪枝菌V991的抑菌效果見圖1，抑菌圈直徑見表1。由圖1及表1可知，6株供試菌株能產生抑菌圈，分別為菌株Y1、Y4、Y6、Y7、SF5和ND，抑菌圈直徑分別為1.11 cm、1.09 cm、1.13 cm、1.19 cm、1.31 cm和1.23 cm。其中，菌株SF5的抑菌圈直徑最大，其次是菌株ND。

圖1 8株供試菌株對大麗輪枝菌V991的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of 8 tested strains on Verticillium dahliae V991

表1 8株供試菌株對大麗輪枝菌V991的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameters of 8 tested strains against Verticillium dahliae V991

2.1.2 高產iturin A菌株的篩選

6株拮抗菌株的iturin A產量見圖2。由圖2可知，菌株Y1、Y4、Y6、Y7、SF5和ND的iturinA產量分別為0.22g/L、0.19g/L、0.25 g/L、0.32 g/L、0.03 g/L、0.35 g/L，其中菌株ND的iturin A產量最高，其次為菌株Y7。初篩中菌株SF5的抑菌圈直徑最大，但iturin A產量最低，分析原因可能是菌株SF5中對大麗輪枝菌V991產生抑菌活性的是iturin家族中的其他脂肽類物質。因此，選取菌株ND作為高產iturin A的菌株。

圖2 高產iturin A菌株的篩選Fig.2 Screening of high yield iturin A-producing strains

2.2 高產iturin A菌株ND的鑒定

基于16S rDNA基因序列菌株ND的系統發育樹見圖3。由圖3可知，菌株ND與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）聚于一支，親緣關系最近，因此，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株ND的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain ND based on 16S rDNA gene sequence

2.3 菌株ND產iturin A發酵工藝研究

2.3.1 發酵培養基成分

碳、氮源種類對菌株ND產iturin A的影響見圖4。由圖4可知，甘油、豆粕粉分別作為碳、氮源時，iturin A的產量最高，分別為0.39 g/L、2.49 g/L。分析原因可能由于豆粕粉是遲效氮源，菌體利用豆粕作為氮源時，生長速率較低，有利于次級代謝產物iturin A的合成[26]。因此，選擇甘油和豆粕粉作為貝萊斯芽孢桿菌ND產iturinA的最優碳、氮源。

圖4 碳源種類（a）和氮源種類（b）對菌株ND產iturin A的影響Fig.4 Effects of types of carbon source (a) and nitrogen source (b)on iturin A produced by strain ND

甘油和豆粕粉添加量對菌株ND產iturin A的影響見圖5。由圖5可知，隨著甘油添加量的升高，iturin A產量呈先降低后升高再降低的趨勢，分析原因可能是當甘油添加量為2%～4%時，利于菌體的生長，營養成分用于菌體生長進而減少iturin A的合成[26]；次級代謝是微生物以初級代謝產物為前體，合成一些無明確功能的物質，當甘油添加量增加至7%時，菌體初級代謝產物增加，導致后期菌體能夠進行次級代謝，使iturin A產量達到最高，為2.71 g/L[27]。由圖5亦可知，隨著豆粕粉添加量的升高，iturin A產量呈先升高后下降的趨勢，分析原因可能是高濃度豆粕粉導致培養基水分驟減，不利于氧氣的傳遞，導致菌體的呼吸速率減慢，限制了iturin A產量的進一步提高[26]。當豆粕粉添加量為12%時，iturin A產量最高，為3.24 g/L。因此，確定甘油和豆粕粉的最優添加量分別為7%、12%。

圖5 甘油（a）和豆粕粉（b）添加量對菌株ND產iturin A的影響Fig.5 Effects of glycerol (a) and soybean meal (b) addition on iturin A produced by strain ND

NaCl、酵母浸粉、KCl、L-谷氨酸鈉添加量對菌株ND產iturin A的影響見圖6。

圖6 NaCl（a）、酵母浸粉（b）、KCl（c）及L-谷氨酸鈉（d）添加量對iturin A產量的影響Fig.6 Effects of NaCl (a),yeast extract powder (b),KCl (c) and L-sodium glutamate (d) addition on the yield of iturin A

由圖6可知，隨著NaCl和KCl添加量的增加，iturin A產量分別從3.22 g/L、3.46 g/L下降至1.74 g/L、2.88 g/L。隨著酵母浸粉和L-谷氨酸鈉添加量的增加，iturinA產量均呈先升高后降低的趨勢，當酵母浸粉和L-谷氨酸鈉的添加量分別為1.6%和0.1%時，iturin A產量最高，分別為3.41 g/L和3.52 g/L。由于NaCl和KCl的抑制作用，在后續發酵過程不添加NaCl和KCl，并確定酵母浸粉和L-谷氨酸鈉的最優添加量分別為1.6%、0.1%。

2.3.2 發酵條件的優化

裝液量、初始pH、接種量、溫度對菌株ND產iturin A的影響見圖7。

圖7 裝液量（a）、pH（b）、接種量（c）及溫度（d）對iturin A產量的影響Fig.7 Effects of liquid volume (a),pH (b),inoculum (c) and temperature (d) on iturin A yield

由圖7可知，隨著裝液量的增加，iturin A產量逐漸下降，分析原因可能是培養基成分占比的增加，會導致溶氧速率下降，進而阻礙菌體的生長發育[28]。隨著初始pH值的升高，iturin A產量呈先升高后下降的趨勢，當初始pH值為8.0時，iturin A產量最高，為3.92 g/L，說明堿性環境利于iturin A的產生。隨著接種量的升高，iturin A產量呈先升高后下降的趨勢，當接種量為10%時，iturin A產量最高，達到4.08 g/L。隨著培養溫度的升高，iturin A產量呈先升高后下降的趨勢，當培養溫度為28 ℃時，iturin A產量最高，達到4.41 g/L，分析原因可能是隨著溫度升高，水分蒸發速度過快，培養基變得干燥，菌體無法生長存活[29]。因此，確定最優裝液量、接種量、初始pH值、培養溫度分別為12%、10%、8.0、28 ℃。

2.3.3 最佳發酵時間的確定

菌株ND發酵過程中，pH值、iturin A產量、甘油殘余量的變化見圖8。

圖8 pH（a）、iturin A產量（b）和甘油殘余量（c）隨發酵時間的變化Fig.8 Changes of pH (a),iturin A yield (b) and glycerol residue content (c) with fermentation time

由圖8可知，菌株ND發酵過程中，pH值呈先降低后升高的趨勢，分析原因可能是由于發酵初期，細胞的生長和呼吸消耗了大量碳源產生有機酸，使得pH下降；當菌體生長到一定數量，有機酸的利用速率加快，pH升高[30]。iturin A產量呈先升高后下降的趨勢，在第5天時，iturin A產量達到最大，為4.76 g/L，后期iturin A產量降低可能是由于營養成分不足，菌體利用菌體產生的次級代謝物質維持生命活動所致[16]。甘油殘余量呈下降的趨勢，在第3～5天時消耗程度最大，分析原因可能是在此階段為了滿足菌體的生長發育和次級代謝產物的形成導致了甘油的大量消耗[22]。因此，確定最佳發酵時間是5 d，在此條件下的iturin A產量居于較高的水平[31-36]。

3 結論

本研究采用平板對峙及高效液相色譜法篩選獲得一株高產iturin A的菌株，編號為ND，經分子生物學技術鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）。菌株ND產iturinA的最佳培養基成分為豆粕粉120 g/L、酵母浸粉16 g/L、L-谷氨酸鈉1 g/L、甘油70 mL/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO41.0 g/L，其余微量元素不變（FeSO4·7H2O 0.15 mg/L、MnSO4·H2O 5 mg/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L）；最佳培養條件為裝液量12%、初始pH值8、接種量10%、培養溫度28 ℃、培養時間5 d。在最優條件下，菌株ND的iturin A產量為4.76 g/L，是優化前（0.35 g/L）的13.6倍。