不同菌種發酵對辣木葉蛋白降解的影響

高 艷，薛橋麗，田 洋，胡永金*

（1.云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學學報 編輯部，云南 昆明 650201）

辣木（Moringa oleifera）又稱“油辣木”、“鼓槌樹”、“山葵木”、“馬羅卜”、“不死樹”、“羅卜樹”等，為辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa）多年熱帶亞熱帶落葉喬木，是一種“藥菜兩用”、“藥食同源”的天然木本植物之一[1]。辣木作為一種新資源全營養食品，含有豐富的蛋白質、多糖、維生素和礦物質等營養成分，而辣木蛋白質極易引起腹瀉等過敏現象，影響人體對蛋白質的消化吸收[2]。

目前，用于降低食物致敏性的加工方式很多，但多數致敏成分具有穩定的過敏原表位，難以被常規技術如高溫等加工方式降解。微生物發酵可降低食物過敏原性，并已證實。微生物通過自身及其分泌的酶系作用，把不溶性高分子物質分解成為可溶性低分子化合物，導致機體產生過敏反應的大分子蛋白質致敏活性喪失并易被機體吸收利用，或者微生物直接將致敏物質通過轉化降為脫敏物質，目前選擇合適的微生物發酵成為極具潛力的食物脫敏方式[3-4]。楊慧等[5]研究發現，枯草芽孢桿菌發酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的α'和α亞基消失，β亞基條帶和大豆球蛋白的酸性亞基條帶密度減，同時大豆球蛋白與β-伴大豆球蛋白的抗原性明顯降低。SONG Y S等[6]研究發現，天然的大豆發酵制品致敏性很低甚至沒有致敏性。CHEN J S等[7]研究發現，在發酵豆粕中大豆球蛋白幾乎全部被降解。吳民熙等[8]采用解淀粉芽孢桿菌和栗褐芽孢桿菌發酵菜籽餅，結果表明菜籽餅粗蛋白明顯被降解。皮瀟文[9]研究發現，花生經納豆芽孢桿菌液態發酵后，產生大量的蛋白酶可將花生蛋白降解成小分子物質，但是目前辣木發酵脫敏的研究報道較少。

本研究以辣木葉粉為原料，采用自然發酵和接種7株不同菌發酵并對其理化指標和主要蛋白的降解情況進行分析，旨在篩選出降解辣木過敏蛋白的優良菌株，為研究辣木發酵脫敏、功能價值以及辣木產品的開發具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉粉：云南農業大學辣木研究所提供；毛霉（Mucor）40899、魯氏酵母（Saccharomyces rouxii）：購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）（基因庫登記號為EU419592.1）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）（基因庫登記號為MG551235.1）、棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）（基因庫登記號為MT851867）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）（基因庫登記號為EU56705）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（基因庫登記號為MF769586）：由實驗室分離獲得。

MRS改良培養基、MRS肉湯、營養瓊脂、營養肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍、福林酚、干酪素、酪氨酸、碳酸鈉、三氯乙酸、甲醛、氫氧化鈉、Tris-HCl、30%制膠液、10%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、過硫酸銨（ammonium persulphate，APS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1645050 Bio-Red電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統、SpectraMax iD5光柵型多功能酶標儀：賽默飛世爾有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；H2100R冷凍離心機：浙江賽德儀器設備有限公司；SW-CK-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；雷磁PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵劑的活化與制備

發酵乳桿菌、植物乳桿菌、棉籽糖乳球菌、納豆芽孢桿菌的培養條件為37 ℃靜置培養24 h；釀酒酵母和魯氏酵母培養條件為30 ℃，180 r/min培養36 h；毛霉40899培養條件為30 ℃培養96 h；分別活化3次，將培養液于4 000 r/min，4 ℃離心10 min，傾去上清，用無菌生理鹽水沖洗沉淀兩次，再用無菌水稀釋，將菌懸液的濃度調整為1.0×108CFU/mL，4 ℃保存備用。

1.3.2 發酵樣品的制備

自然發酵樣品：稱取10 g辣木葉粉作為發酵基質，以1∶10（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，分別在37 ℃條件下自然發酵0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h進行取樣，冷凍干燥，-80 ℃保存備用。

接菌發酵樣品：稱取10 g辣木葉粉作為發酵基質，以1∶10（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，調節初始pH為7，按5%（V/V）的接種量分別添加菌種，在37 ℃條件下，分別發酵0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h進行取樣，冷凍干燥，-80 ℃保存備用。

1.3.3 測定方法

pH的測定：參照喻世哲等[10]的方法，并稍作修改。將不同發酵階段的樣品振蕩搖勻，取適當發酵液采用pH計測定發酵樣品pH。

蛋白酶活力的測定：粗酶液制備是將不同發酵階段的辣木樣品于8 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液即為粗酶液。粗酶液現做現用，不重復使用。蛋白酶活力的測定參照王欣宇[11]的方法進行測定。

總酸的測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》進行測定[12]。

氨基酸態氮的測定：參照GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》進行測定[13]。

辣木蛋白的提取與含量測定：參照YANG H等[14-15]的方法，采用超聲輔助提取法提取辣木葉蛋白。準確稱取凍干發酵樣品5 g，加入蒸餾水50 mL，混合均勻，調節pH至8，超聲6 min，45 ℃水浴60 min后，取適當體積提取液于8 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液，-80 ℃分裝儲存待測。參照代佳和等[15]的考馬斯亮藍法進行測定。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證試驗

蛋白提取及定量：蛋白提取采用1.3.2辣木蛋白提取的方法進行提取，然后采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒法測定蛋白樣品濃度，-20 ℃保存，備用。

電泳條件：參照TAIWO A等[16]的方法并稍作修改。濃縮膠和分離膠配方如表1所示。電壓為恒壓，分離膠120 V，150 min；濃縮膠50 V，30 min；上樣質量固定為40 μg；上樣緩沖液為5 μL。電泳結束后，電泳凝膠用雅酶快速染液染色1 h，用蒸餾水進行脫色至電泳條帶清晰可見，電泳凝膠采用凝膠成像儀掃描凝膠成像。

表1 濃縮膠和分離膠配方Table 1 Formula of concentrated glue and separating glue

1.3.5 數據處理

各指標采用SPSS 18.0對數據進行整理分析，Origin 9.0進行繪圖；電泳圖采用GelDocXR+凝膠成像系統掃描成像。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中pH的變化

辣木葉在不同發酵時期pH變化見圖1。由圖1可知，在發酵過程中，自然發酵的pH維持在5.60～5.66范圍內，發酵乳桿菌、植物乳桿菌、棉籽糖乳球菌、納豆芽孢桿菌在0～48 h的發酵階段pH值逐漸下降，隨后pH值穩定在4.7左右。釀酒酵母、魯氏酵母、毛霉40899在發酵過程中pH值呈上升趨勢。不同的菌種在相同條件下發酵的pH值存在一定差異，這可能是因為菌種在發酵過程中產酸、產蛋白酶和糖化酶能力不同，從而導致pH值存在差異[17-18]。

圖1 辣木葉粉在不同發酵時期pH變化Fig.1 Changes of pH of Moringa oleifera leaf powder during different fermentation periods

2.2 發酵過程中總酸的變化

辣木葉在不同發酵階段總酸變化見圖2。由圖2可知，發酵乳桿菌、植物乳桿菌、棉籽糖乳球菌、納豆芽孢桿菌發酵辣木葉的總酸隨著pH下降而上升，最后趨于穩定。釀酒酵母、魯氏酵母、毛霉40899發酵至36 h時總酸開始逐漸下降，這一變化與pH變化相一致，這可能是因為微生物產蛋白酶，蛋白酶加快蛋白質降解，產生了小肽、游離氨基酸和胺類等堿性物質，使得pH值升高，總酸含量下降[10，19]。

圖2 辣木葉粉在不同發酵時期總酸含量的變化Fig.2 Changes of total acid contents of Moringa oleifera leaf powder during different fermentation periods

2.3 發酵過程中蛋白酶活力的變化

微生物發酵過程中產生的蛋白酶能夠將部分蛋白質降解成分子質量較小的肽類物質和氨基酸[20]。辣木葉經不同菌種在不同發酵階段的蛋白酶活力變化如圖3所示。由圖3可知，發酵過程中蛋白酶活力總體呈先上升后下降的趨勢。發酵至48 h時，納豆芽孢桿菌蛋白酶活力最高為270.58 U/mL，棉籽糖乳球菌發酵蛋白酶活力為248.34 U/mL，發酵乳桿菌發酵蛋白酶活力為236.26U/mL，而釀酒酵母在60h時達到最大活性為217.90U/mL，魯氏酵母在72 h時達到最大活性為222.74 U/mL，毛霉40899在96 h時達到最大活性為231.31 U/mL，植物乳桿菌在發酵過程中蛋白酶活力較低。

圖3 辣木葉粉在不同發酵時期蛋白酶活力的變化Fig.3 Changes in the protease activity of Moringa oleifera leaf powder during different fermentation periods

2.4 發酵過程中蛋白含量的變化

辣木葉粉經不同菌種在不同發酵階段的蛋白含量變化見圖4。

圖4 辣木葉粉在不同發酵時期蛋白含量的變化Fig.4 Changes of protein content of Moringa oleifera leaf powder during different fermentation periods

由圖4可知，辣木葉粉經發酵后蛋白質均有所降解，其中對蛋白降解效果最明顯的為棉籽糖乳球菌、納豆芽孢桿菌和毛霉40899，發酵過程中蛋白含量分別由47.56 mg/g、42.77 mg/g、44.49 mg/g 下降至21.95 mg/g、20.24 mg/g、23.38 mg/g。棉籽糖乳球菌和納豆芽孢桿菌在0～96 h發酵階段，蛋白含量逐漸下降，其蛋白含量明顯低于自然發酵組。隨著發酵時間的延長，蛋白降解速度明顯下降，這可能是因為菌株生長到一定時間后，菌群快速繁殖消耗了大量的營養物質，使得菌株產蛋白酶能力減弱，從而導致蛋白溶解性下降[21-22]。而毛霉40899發酵至36 h時，蛋白含量開始緩慢下降，發酵時間處于48～96 h階段，蛋白質含量下降較為明顯，這是由于毛霉最佳生長時間為96 h，在發酵初始階段，毛霉緩慢生長，產蛋白酶能力較弱，隨著發酵時間延長至96 h時，毛霉快速生長，產生大量的蛋白酶加快了蛋白質的降解[23]。

2.5 發酵過程中氨基酸態氮的變化

微生物發酵過程中氨基酸態氮含量是反映蛋白質水解的重要指標[10，24]。辣木葉粉經不同菌種在不同發酵階段的氨基態氮含量變化見圖5。由圖5可知，辣木葉粉經發酵后氨基態氮含量隨發酵時間的延長而上升，這主要是因為發酵過程中微生物不斷生長繁殖，產生蛋白酶將蛋白質降解，導致氨基酸態氮的含量不斷上升[25]。納豆芽孢桿菌和棉籽糖乳球菌發酵液的最高氨基態氮含量分別為0.46 mg/100 mL、0.45 mg/100 mL，明顯高于其他組，這一結果與蛋白含量變化相一致。

圖5 辣木葉粉在不同發酵時期氨基態氮含量的變化Fig.5 Changes of amino nitrogen content of Moringa oleifera leaf powder during different fermentation periods

2.6 發酵過程中蛋白降解的電泳分析

辣木葉粉經不同菌種在不同發酵時期的蛋白以及標準蛋白的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜見圖6，根據電泳圖譜的變化來探討辣木葉粉蛋白的降解趨勢。

圖6 辣木葉在不同發酵時期的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis patterns of Moringa oleifera leaf powder during different fermentation stages

由圖6可知，利用水溶液浸提的辣木葉粉蛋白主要為分子質量為70 kDa和35 kDa的兩種蛋白。在0～48 h發酵階段時，辣木葉粉經自然發酵與接種發酵乳桿菌、植物乳桿菌、棉籽糖乳球菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母、魯氏酵母、毛霉40899的蛋白條帶基本相同，70 kDa和35 kDa的蛋白幾乎沒有出現降解（見圖6A～6E），這可能與蛋白酶活力以及酶作用時間有關[22]。RAHAMAN T等[26]研究也表明，對蛋白發揮降解作用的主要是蛋白酶類。

如圖6F所示，發酵至60 h時，納豆芽孢桿菌（泳道6）電泳條帶顯示70 kDa和35 kDa的蛋白明顯被降解，說明納豆芽孢桿菌對辣木蛋白具有降解作用。如圖6G所示，發酵至72 h時，棉籽糖乳球菌（泳道5）和納豆芽孢桿菌（泳道6）蛋白條帶幾乎全部被降解，棉籽糖乳球菌對辣木蛋白也表現出降解作用，這可能是因為在發酵前期階段產生了大量的蛋白酶，在發酵后期雖然蛋白酶活力有所下降，但作用時間較長，使得蛋白質降解，蛋白含量下降[20]。總之，蛋白電泳圖出現蛋白條帶逐漸變淺或消失，說明了蛋白發生了降解或變性聚集，也說明了其含量不斷降低，達到降解目的[27]。

如圖6H所示，繼續發酵至96 h時，棉籽糖乳球菌（泳道5）和納豆芽孢桿菌（泳道6）的蛋白條帶與上一時期無明顯變化，70 kDa的蛋白均沒有被檢測到，35 kDa的蛋白幾乎完全被降解。因此，本研究認為在發酵過程中對辣木葉蛋白降解效果最佳的菌株為納豆芽孢桿菌和棉籽糖乳球菌。

3 結論

通過比較自然發酵與7種不同菌株發酵對辣木葉的理化指標及SDS-PAGE電泳圖譜結果得出，納豆芽孢桿菌、棉籽糖乳球菌、發酵乳桿菌能夠很快適應發酵基質并快速產生蛋白酶，但對辣木蛋白降解效果較明顯的主要為納豆芽孢桿菌、棉籽糖乳球菌。發酵結束時，蛋白含量下將至20.24 mg/g、21.95 mg/g；氨基酸態氮含量隨之升高；納豆芽孢桿菌和棉籽糖乳球菌能夠明顯降解辣木70 kDa和35 kDa的兩種主要蛋白；確定納豆芽孢桿菌和棉籽糖乳球菌為發酵降解辣木蛋白的優良菌株，這對辣木發酵脫敏以及辣木產品的開發具有重要意義。納豆芽孢桿菌和棉籽糖乳球菌雖在很大程度上降解了辣木葉蛋白，但未將其徹底消除，其發酵工藝、發酵后的致敏性以及發酵降解辣木蛋白的機理還需進一步研究。