游離棉酚脫除菌株的分離鑒定及體內(nèi)定植效果研究

吳慧昊，舒文秀，李姿茹，劉梓琦，臧榮鑫，周 瑞，徐紅偉*

（1.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

我國(guó)蛋白質(zhì)飼料資源嚴(yán)重短缺，大量依賴(lài)外國(guó)進(jìn)口，以大豆為例，2019年的大豆進(jìn)口總量占年使用量的85%，而棉籽粕的年利用率卻不足30%，棉籽粕粗蛋白含量在44%左右，代謝能量為7.4～11.99 MJ/kg，是較好的雜粕蛋白資源[1]。但因其中含有的內(nèi)源毒性物質(zhì)-游離棉酚，可促進(jìn)臨床中毒、肝損傷、生殖毒性和免疫危害，限制了其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的有效利用[2-5]。

為了改善棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)棉酚的脫除方法進(jìn)行了大量研究，包括物理、化學(xué)和生物脫毒法[6-9]。微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量生物酶，這些酶可以與棉籽粕中的有害物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成無(wú)毒無(wú)害的化合物，這種利用生物技術(shù)脫毒的方法稱(chēng)為生物脫毒法，包括：酶解法、微生物發(fā)酵法、菌酶協(xié)同發(fā)酵法。微生物發(fā)酵技術(shù)是改善棉籽粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、提高棉籽粕飼用品質(zhì)的一個(gè)重要手段，棉籽粕經(jīng)微生物發(fā)酵后可產(chǎn)生大量的生物酶和益生菌[10]，近年來(lái)成為棉粕脫毒的研究熱點(diǎn)。

芽孢桿菌（Bacillus）作為理想的發(fā)酵菌種，屬兼性厭氧菌，對(duì)外界有害因子抵抗力較強(qiáng)。芽孢桿菌在棉粕脫毒的同時(shí)可釋放出高活性的分解酵素，還能產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、氨基酸、促生長(zhǎng)因子等，減少抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)動(dòng)物消化利用的影響。芽孢桿菌定植于腸道可以有效阻止致病菌與腸道黏膜受體結(jié)合，抑制病原菌的擴(kuò)散；且能消耗大量的氧氣，阻止腸道中部分有害需氧菌的繁殖，為乳酸菌、雙歧桿菌等有益厭氧菌的生長(zhǎng)提供條件，使腸道菌群得以穩(wěn)定[11-12]。芽孢桿菌還可改善腸道形態(tài)，強(qiáng)化免疫力，增強(qiáng)動(dòng)物腸道健康[13-16]。

對(duì)于游離棉酚的脫除菌株，國(guó)內(nèi)外大量研究集中于真菌，包括土曲霉[17]、黑曲霉[18]、紅曲霉[19]以及產(chǎn)朊假絲酵母[20]、熱帶假絲酵母[21-22]等，對(duì)于芽孢桿菌的報(bào)道較少。亓秀曄等[23]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BLCC1-0039和植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0092復(fù)配厭氧發(fā)酵棉粕72 h，游離棉酚脫除率達(dá)到了61.58%，聶蓬勃[24]選出一株對(duì)棉粕中游離棉酚降解效果較好的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）B2，菌株發(fā)酵周期為48 h，料水比1∶1（g∶mL），接種量2%，溫度28.0 ℃，游離棉酚的降解率達(dá)最大51.7%。海米代·吾拉木[25]從棉花秸稈中分離出死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）和漠海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis），對(duì)棉籽油的脫毒率分別為21.1%和22.2%。

本研究以藜麥莖葉和番茄桿為原料，分離出高效游離棉酚脫除菌株，并通過(guò)人工胃液、人工腸液耐受實(shí)驗(yàn)，抗生素敏感實(shí)驗(yàn)及表面特性實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株的體內(nèi)定植效果進(jìn)行研究，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定，以期為棉籽粕生物脫毒提供優(yōu)良菌株，為棉籽粕在畜禽生產(chǎn)中的合理利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料藜麥莖葉：采自甘肅省甘南藏族自治州臨潭縣；番茄桿：采自河北省承德市圍場(chǎng)滿族蒙古族自治縣。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、瓊脂粉（均為生化試劑）、藥敏紙片、微生物微量生化反應(yīng)管：杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸銨、正己烷（均為分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；胃蛋白酶、胰蛋白酶（均為生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，pH值7.0±0.2。121 ℃滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基中添加18 g/L瓊脂。

降解棉酚選擇培養(yǎng)基采用無(wú)糖查氏醋酸棉酚液體培養(yǎng)基：硫酸銨5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、氯化鈉0.1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈣1 g/L、酵母粉0.2 g/L、醋酸棉酚0.3%，pH自然。固體培養(yǎng)基為上述液體培養(yǎng)基加15～20 g/L瓊脂。121 ℃滅菌20 min。

棉粕固態(tài)培養(yǎng)基：稱(chēng)取過(guò)60目篩經(jīng)粉碎的棉籽粕84.1 g、麩皮9.4 g、紅糖6.5 g于500 mL發(fā)酵袋中，121 ℃滅菌20 min，后將其冷卻至室溫，加入滅菌蒸餾水66 mL待用。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750全自動(dòng)高壓滅菌器：日本三洋公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BX51T-32P01數(shù)碼光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司；1285生物安全柜：美國(guó)熱電公司；UV-2450PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；HH.B11.600-BS-II電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；DHG-9140A 新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：寧波江南儀器廠；110X50 ZHWY往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；DYY-12電泳儀：北京市六一儀器廠；T960聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海力康生物醫(yī)療控股有限公司；MX-E渦旋混勻儀：上海力朗儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離純化

分別稱(chēng)取5 g藜麥莖葉樣本和番茄桿樣本，剪碎分別裝入50 mL無(wú)菌生理鹽水中，于250 mL三角瓶中搖床振蕩20 min搖勻，靜置備用。采用梯度稀釋法進(jìn)行菌種的分離，挑取單菌落，通過(guò)平板反復(fù)劃線純化菌株，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種后斜面保藏至4 ℃冰箱。

1.3.2 游離棉酚脫除菌株的初篩

將分純菌株點(diǎn)種在降解棉酚選擇培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h，觀察其菌落生長(zhǎng)情況。菌落生長(zhǎng)記為“+”，菌落不生長(zhǎng)記為“-”，每組處理3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3 游離棉酚脫除菌株的復(fù)篩

將初篩菌株以3%的接種量，接種于棉粕固態(tài)培養(yǎng)基中，充分混合均勻，37 ℃靜置發(fā)酵72 h。將棉粕固態(tài)培養(yǎng)基在45 ℃烘干24 h，最終檢測(cè)各菌株的棉酚脫除效果，每組處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 菌株產(chǎn)蛋白酶實(shí)驗(yàn)

將具有棉酚降解能力的菌株點(diǎn)種在酪蛋白選擇培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)72 h，測(cè)定平板上水解圈直徑D（mm），每組處理3 個(gè)重復(fù)。

1.3.5 分析檢測(cè)

蛋白酶活性測(cè)定：參照商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》。利用福林法測(cè)得酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為y=0.008 9x+0.011 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1。按照酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蛋白酶活性。

蛋白酶活力單位定義：在40 ℃下每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U/mL）。

棉酚含量測(cè)定：參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（international standardization organization，ISO）6866—1985《游離棉酚和總棉酚的測(cè)定》。游離棉酚含量計(jì)算公式如下：

式中：X為游離棉酚含量，mg/kg；A為吸光度值；m為試樣質(zhì)量，g；V為測(cè)定用濾液的體積，mL；a為游離棉酚質(zhì)量吸收系數(shù)，62.5 L/（g·cm）。

游離棉酚脫除率計(jì)算公式如下：

式中：X為游離棉酚脫除率，%；X0為培養(yǎng)0 h游離棉酚含量，mg/kg；Xt為培養(yǎng)72 h游離棉酚含量，mg/kg。

1.3.6 菌株耐人工胃液、腸液實(shí)驗(yàn)

菌株種子液制備：從冰箱保存的斜面培養(yǎng)基上挑取一至三環(huán)菌接入含5 mL LB肉湯培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，置于恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)37 ℃，200 r/min培養(yǎng)20 h，得到一級(jí)種子液。將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至裝液量為50 mL/250 mL液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)20 h，得到最終發(fā)酵用種子液。

菌懸液的制備：吸取10 mL種子液，8 000 r/min離心10 min，去上清，用無(wú)菌水洗滌菌體2次，用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（0.2 mol/L，pH值7.0）重懸菌體，得到終濃度為108CFU/mL的菌懸液。微生物計(jì)數(shù)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法。

菌株活化后制成菌體濃度為108CFU/mL的菌懸液，按4%的接種量接入人工胃液、腸液（配制方法分別參見(jiàn)文獻(xiàn)[26-27]）中，分別于0、2 h、4 h從發(fā)酵液中吸取菌懸液，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)坎贾罫B固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)，選取菌落數(shù)30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組處理3個(gè)重復(fù)，取平均值。計(jì)算菌株對(duì)人工胃液、腸液的耐受力，其計(jì)算公式如下：

式中：N為菌株對(duì)人工胃液（腸液）的耐受力，%；Nt為各時(shí)間段培養(yǎng)基活菌數(shù)，CFU/mL；N0為培養(yǎng)基初始活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.7 菌株表面特性測(cè)定

（1）表面疏水性

采用微生物粘著碳烴化合物法（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）[28]。取篩選菌株種子液離心（8000r/min，10 min），棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌菌體3次后將菌重懸，調(diào)整菌懸液的OD600nm值為0.8。在試管內(nèi)加入4 mL菌懸液、1 mL正己烷，對(duì)照組不加正己烷，封口，用旋渦振蕩儀劇烈振蕩60 s，靜置15 min至液體分層。吸取下相水溶液3 mL，以PBS為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定其吸光度值，細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性（cell-surface hydrophobicity，CSH）按如下公式計(jì)算：

式中：CSH為細(xì)胞表面疏水性，%；A0為對(duì)照組吸光度值；AS為實(shí)驗(yàn)組吸光度值。

（2）表面凝集性

菌株種子液離心（8 000 r/min，10 min），棄上清液，用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次后將菌重懸，調(diào)整菌懸液的OD600nm值為0.8。取5 mL菌懸液于37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)2 h后，輕輕吸取200 μL上層懸浮液，不搖動(dòng)，測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，菌體凝集性計(jì)算公式如下：

式中：A為菌體凝集性，%；OD0為菌懸液初始吸光度值；ODt為菌懸液靜置后吸光度值。

1.3.8 菌株對(duì)抗生素的敏感實(shí)驗(yàn)

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法（又稱(chēng)（Kirby-Bauer）K-B法）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)菌株的抗生素耐藥性[29]。

1.3.9 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：觀察菌落形狀、大小、顏色、表面特征等；對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)、大小、革蘭氏染色結(jié)果。

生理生化試驗(yàn)：采用微量生化反應(yīng)管對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶、硫化氫、糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[30]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[31]，對(duì)菌株的生理生化特征進(jìn)行分析，確定目標(biāo)菌株種屬。

分子生物學(xué)鑒定：將菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)20 h，在培養(yǎng)基中挑取菌體，使用Solarbio的DNA試劑盒提取菌株基因組DNA，以其為模板，采用16S rDNA通用引物27 F和1492 R擴(kuò)增目標(biāo)菌株16S rDNA基因序列。PCR擴(kuò)增體系：菌體DNA1μL，PCRPremix25μL，27f（20 pmol/μL）0.5 μL，1492r（20 pmol/μL）0.5 μL，16S-free H2O 23 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃5 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物測(cè)序由大連美侖生物技術(shù)有限公司完成。將所得結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）檢索，選取同源性較高的已知菌種的16S rDNA序列，采用MEGA 7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離棉酚脫除菌株篩選、分離及純化

分別稱(chēng)取5 g藜麥莖葉樣本和番茄桿樣本，剪碎分別裝入于250 mL三角瓶中，加入無(wú)菌水搖床振蕩20 min，采用梯度稀釋涂平板法，反復(fù)劃線分離，最終得到16株菌株，通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，16株菌均為桿菌，芽孢存在于菌體中央、頂端，以中央芽孢居多。具體菌落形態(tài)特征見(jiàn)表1。由表1可知，大部分分離菌株菌落表面粗糙，不規(guī)則，菌落較大，顏色呈灰白色，不透明，是絕大多數(shù)芽孢桿菌的典型菌落特征。

2.2 游離棉酚脫除菌株初篩

將16株分純菌株利用醋酸棉酚無(wú)糖查氏培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h，各菌株的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。由表2可知，有9株菌在0.3%醋酸棉酚無(wú)糖查氏培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，其余菌株均不生長(zhǎng)，選取生長(zhǎng)最快的菌株ZY-P.001、S-77和ZY-A.001進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

表2 游離棉酚脫除菌株初篩結(jié)果Table 2 Primary screening results of free gossypol-degrading strains

2.3 游離棉酚脫除菌株的復(fù)篩結(jié)果

參照ISO 6866—1985《游離棉酚和總棉酚的測(cè)定》方法，測(cè)得3株菌的游離棉酚脫除率見(jiàn)表3。由表3可知，菌株S-77對(duì)于棉酚脫除率為81.30%，顯著高于菌株ZY-P.001和菌株ZY-A.001（P＜0.05），菌株ZY-P.001與ZY-A.001棉酚脫除率也存在顯著差異（P＜0.05），選取棉酚脫除率最高的菌株S-77和ZY-P.001進(jìn)行蛋白酶產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)研究。

表3 游離棉酚脫除菌株篩選結(jié)果Table 3 Screening results of free gossypol-degrading strains

2.4 菌株ZY-P.001及S-77產(chǎn)蛋白酶實(shí)驗(yàn)

菌株ZY-P.001和S-77點(diǎn)種在酪蛋白選擇培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)72 h，測(cè)定平板上水解圈直徑D（mm），菌株S-77表現(xiàn)出較好的產(chǎn)酶特性，透明圈直徑為24.2 mm，而菌株ZY-P.001透明圈直徑為10.7 mm，選取菌株S-77進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)定蛋白酶活性，為767.27 U/g。蛋白酶產(chǎn)生有利于抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除，可以將大分子蛋白降解成小分子肽、酸溶蛋白，可以提高發(fā)酵風(fēng)味，增加適口性，改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力，提高機(jī)體代謝水平，具有促進(jìn)生長(zhǎng)、降低腹瀉率功效。因此，選取高產(chǎn)蛋白酶菌株對(duì)發(fā)酵蛋白飼料有著重要意義。選取產(chǎn)酶高的菌株S-77進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.5 菌株耐人工胃液、腸液實(shí)驗(yàn)

食物進(jìn)入胃中一般停留4～5 h排空，因此，菌株要在動(dòng)物體內(nèi)定植，需要對(duì)人工胃液、腸液有一定耐受性。菌株S-77對(duì)人工胃液、腸液耐受性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌株S-77人工胃液（a）及腸液（b）耐受性Fig.1 Tolerance of strain S-77 to simulated gastric juice (a) and simulated intestinal fluid (b)

由圖1可知，菌株S-77隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，存活率出現(xiàn)了一定程度的下降，且在0～2 h存活率顯著下降（P＜0.05），4 h后菌株存活率雖有下降，但仍能達(dá)到71.16%，大部分菌株可由胃部進(jìn)入腸道。菌株S-77隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，在人工腸液中的存活率出現(xiàn)了下降，但一直保持90%以上，8 h后的菌株存活率為93.34%，菌株展現(xiàn)出了對(duì)人工腸液的強(qiáng)力耐受性。

2.6 菌株S-77表面特性實(shí)驗(yàn)

菌株能否較好地黏附并定植于腸道內(nèi)取決于菌株的表面特性，只有有效定植才能發(fā)揮其益生功能。對(duì)菌株S-77的表面疏水性和表面凝集性進(jìn)行測(cè)定，菌株S-77的表面疏水性為60.89%，表面凝集性為72.27%，表明菌株S-77能較好黏附到腸道上皮細(xì)胞和黏膜表面上，得以發(fā)揮其益生功效。

2.7 菌株S-77對(duì)抗生素的敏感實(shí)驗(yàn)

菌株S-77對(duì)抗生素的敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，菌株S-77對(duì)常用抗生素青霉素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)慶大霉素表現(xiàn)為相對(duì)耐藥，對(duì)其余抗生素均表現(xiàn)出敏感，敏感率、抗藥率和中介率分別為83.33%、8.33%、8.33%。結(jié)果表明，菌株S-77作為功能菌株添加入棉粕動(dòng)物飼料是安全的，其無(wú)耐藥基因，不會(huì)將其攜帶的耐藥基因水平傳達(dá)給腸道中的致病類(lèi)菌，導(dǎo)致此類(lèi)菌獲得耐藥性。

表4 菌株S-77藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of drug sensitivity tests of strain S-77

2.8 游離棉酚脫除菌株S-77的鑒定

2.8.1 菌株S-77的形態(tài)學(xué)觀察

菌株S-77的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。由圖2a可知，S-77菌落呈乳白色，不透明，菌落較大，表面粗糙，邊緣不整齊，無(wú)明顯褶皺；由圖2b可知，菌株S-77為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，單個(gè)、成對(duì)存在，芽孢位于菌體中央，卵圓。

圖2 菌株S-77菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of strain S-77

2.8.2 菌株S-77的生理生化試驗(yàn)

菌株S-77的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，菌株S-77可還原硝酸鹽，可液化明膠，可在6.5%的高鹽溶液中生存，對(duì)于絕大多數(shù)糖類(lèi)不可利用，但可利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、棉子糖和蕈糖，菌株不產(chǎn)尿素酶，接觸酶反應(yīng)為陰性。

表5 菌株S-77生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of physiological and biochemical tests of strain S-77

2.8.3 菌株S-77的分析生物學(xué)鑒定

提取菌株S-77的基因組DNA，并進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株S-77在1 500 bp附近有明顯條帶，經(jīng)過(guò)測(cè)序，菌株S-77的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 400 bp。

圖3 菌株S-77 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of 16S rDNA gene PCR amplification products of strain S-77

將擴(kuò)增得到的16S rDNA送至大連美侖生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成提交菌株S-77的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，菌株S-77與Bacillus toyonensisstrain BCT-7112同源性為99.43%，覆蓋率100%，因此結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征，菌株S-77被鑒定為東洋芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）。

圖4 基于16S rDNA序列菌株S-77的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain S-77 based on 16S rDNA sequence

3 結(jié)論

從河北省承德市圍場(chǎng)滿族蒙古族自治縣番茄桿分離得到一株降解棉酚芽孢桿菌，菌株S-77經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化及16S rDNA序列分析，鑒定菌株S-77為芽孢桿菌屬（Bacillus）東洋芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）。

菌株S-77具有高效的游離棉酚脫毒能力，棉酚脫毒率為81.30%，其在使其游離棉酚含量降低的同時(shí)，菌株產(chǎn)蛋白酶活性為767.27 U/g。菌株S-77具有很好的耐人工胃液、腸液效果，且具有良好的表面特性，具備黏附于宿主腸壁細(xì)胞的能力，可定植在腸道內(nèi)發(fā)揮其益生作用。菌株S-77對(duì)抗生素敏感，作為益生菌添加入動(dòng)物飼料是安全的。

目前，對(duì)于棉籽粕的脫毒研究還處于試驗(yàn)階段，研究集中于對(duì)脫毒菌株的篩選及脫毒工藝的優(yōu)化，對(duì)其脫毒機(jī)理方面尚無(wú)研究，因此，棉籽粕脫毒機(jī)理及其在畜禽生產(chǎn)應(yīng)用方面將是下一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容。