釀造鮮味醬油調(diào)節(jié)大鼠血壓機(jī)制的研究

羅興力，符 瑤，彭 誠(chéng)，鐘 寶*

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.吉林市人民醫(yī)院 輸血科，吉林 吉林 132102；3.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

目前，由于生活方式的改變，高血壓患病率在世界范圍內(nèi)增長(zhǎng)迅速，已經(jīng)為各國(guó)敲響了警鐘。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓的重要內(nèi)分泌系統(tǒng)，該調(diào)節(jié)系統(tǒng)中血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是調(diào)控血壓平衡的核心，AngⅡ通常與血管緊張素1型受體（angiotensin type 1 receptor，AT1R）結(jié)合誘發(fā)血管收縮，進(jìn)而導(dǎo)致升高血壓[1-3]。當(dāng)Ang II與AT1R結(jié)合時(shí)，除了血管收縮外，還會(huì)引起鈉和水潴留，以及醛固酮（aldosterone）分泌，導(dǎo)致血管收縮、炎癥和纖維化，最終使血管內(nèi)皮功能失調(diào)[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究結(jié)果表明，高血壓患者體內(nèi)的腎素、血管緊張素1型受體、類固醇11β-羥化酶基因CYP11B1、醛固酮合成酶基因CYP11B2等的表達(dá)水平會(huì)顯著升高，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)尿液中鈉、鉀離子水平的紊亂，如尿液中鉀含量的減少和鈉鉀腺呤核苷三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶α1基因NKAα1表達(dá)水平的下降[5-6]。

高脂高鹽飲食的攝入會(huì)增加AngⅡ的分泌，導(dǎo)致RAAS的激活，進(jìn)而引起血管的收縮，導(dǎo)致血壓的升高[7-10]。目前，高血壓的治療除使用腎素抑制劑，血管緊張素抑制劑，醛固酮抑制劑等藥物外，國(guó)際高血壓聯(lián)盟倡導(dǎo)使用食物預(yù)防和調(diào)節(jié)血壓。醬油（soy sauce）作為一種日常調(diào)味料，含鹽量約為22%～24%，是人體鹽攝入的重要來(lái)源之一[11-14]。有研究表明，韓國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵醬油雖然含有高的鹽分，但可以有效改善大鼠血壓的升高[15]；日本的發(fā)酵醬油可以通過(guò)改善血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的表達(dá)調(diào)節(jié)大鼠血壓的升高[16]。本課題組前期研究的結(jié)果也顯示，中國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵醬油可以有效的調(diào)節(jié)高脂高鹽飲食誘導(dǎo)的RAAS系統(tǒng)的激活，進(jìn)而改善大鼠血壓的升高[17]。

目前，我國(guó)對(duì)醬油功效的評(píng)價(jià)研究主要為傳統(tǒng)發(fā)酵醬油，對(duì)鮮味醬油的功能性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此本研究以釀造鮮味醬油為原料，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)RAAS系統(tǒng)相關(guān)生物參數(shù)指標(biāo)的調(diào)節(jié)，揭示釀造鮮味醬油對(duì)血壓的調(diào)節(jié)機(jī)理，為我國(guó)大豆發(fā)酵食品的功效性研究提供新的思路，也為調(diào)節(jié)和預(yù)防高血壓提供合理參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD大鼠：吉林大學(xué)；普通飼料（脂肪含量10%）、高脂飼料（脂肪含量60%）：美國(guó)research diets公司；釀造鮮味醬油（食品級(jí)）：吉林市某大型超市；氯化鈉（分析純）：沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三脂（triglycerides，TG）測(cè)定試劑盒：美國(guó)Mybiosource公司；醛固酮、血管緊張素Ⅱ測(cè)定試劑盒：美國(guó)Enzo Life Sciences公司；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒、互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：日本Takara公司；SYBR green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒：日本TOYOBO公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BP-2000無(wú)痛血壓分析儀：美國(guó)Visitech system公司；大鼠代謝籠：河北睿騰金屬制品有限公司；LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）儀：瑞士Roche公司；柏精-BioDrop μLite+超微量核酸蛋白分析儀：英國(guó)BioDrop公司；MiniAmp Plus Thermal Cycler cDNA 轉(zhuǎn)錄儀、Thermal K3酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermal公司；Agilent 7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 醬油樣品的制備

采用莫爾法測(cè)定醬油中的鹽度[18]，并用蒸餾水將醬油的鹽度調(diào)整為8%，用于高脂和醬油飲食組[15]，同時(shí)配制8%濃度的鹽水用于高脂和高鹽飲食組。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

24只6周齡雄性SD大鼠（約180 g）在室內(nèi)溫度為（24±1）℃、相對(duì)濕度為（65±2）%的條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。將SD大鼠隨機(jī)分成3組，每組8只，分別為普通飲食（normal diet，ND）組、高脂和高鹽飲食（high-fat and high-salt diet，HFHS）組、高脂和醬油飲食（high-fat and soy sauce diet，HFSS）組，其中ND組飼喂普通飼料并灌胃蒸餾水，HFHS組飼喂高脂飼料并灌胃鹽水，HFSS組飼喂高脂飼料并灌胃醬油，灌胃量均為10 mL/kg，連續(xù)灌胃10周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物保護(hù)倫理委員會(huì)要求（批準(zhǔn)號(hào)：2021013）。

1.3.3 基礎(chǔ)代謝參數(shù)的測(cè)定

每天記錄一次食物攝入量，每周測(cè)量一次體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)最后兩周，將大鼠飼養(yǎng)于代謝籠中24 h，記錄飲水量，收集尿液，并記錄尿液排出量。

1.3.4 血壓的測(cè)量

采用無(wú)痛尾套法[7]每?jī)芍軠y(cè)量一次血壓，記錄大鼠收縮壓的變化情況。

1.3.5 鈉、鉀離子含量的測(cè)定

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法[19]測(cè)定尿液中鈉、鉀離子的含量。

1.3.6 血液參數(shù)的測(cè)定

灌胃處理10周后，將SD大鼠麻醉取血，血液在3000r/min、4 ℃條件下離心10 min，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清中總膽固醇、甘油三酯、血管緊張素Ⅱ和醛固酮的含量。

1.3.7 腎臟中相關(guān)基因的表達(dá)分析

解剖時(shí)，取大鼠腎臟，放入-80℃冰箱保存。使用Trizol試劑提取腎臟組織的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-FQ-PCR）[7]測(cè)定腎臟組織中血管緊張素1型受體、類固醇11β-羥化酶、醛固酮合成酶和鈉鉀ATP酶α1基因的表達(dá)情況，本研究所用引物[17]見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)值均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SD大鼠基礎(chǔ)代謝參數(shù)的變化

SD大鼠每天的食物和水?dāng)z入量、尿液排出量及灌胃期間體質(zhì)量的變化見(jiàn)圖1。由圖1A～1C可知，所有處理組SD大鼠每天的食物攝入量和初始體質(zhì)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與ND組（432.00 g）相比，HFHS組（544.87 g）和HFSS組（514.37g）SD大鼠的最終體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05），但HFSS組SD大鼠的最終體質(zhì)量顯著低于HFHS組（P＜0.05）。由圖1D可知，HFHS組（28.37 mL/d）和HFSS組（29.50 mL/d）SD大鼠每天的水?dāng)z入量顯著高于ND組（21.12 mL/d）（P＜0.05），但HFSS組和HFHS組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；HFHS組（20.25 mL/d）和HFSS組（22.46 mL/d）SD大鼠每天的尿液排出量顯著高于ND組（15.00 mL/d）（P＜0.05），且HFSS組SD大鼠的尿液排出量顯著高于HFHS組（P＜0.05）。結(jié)果表明，同等鹽度攝入，醬油可以改善大鼠的基礎(chǔ)代謝參數(shù)。

圖1 不同處理組SD大鼠基礎(chǔ)代謝特征參數(shù)的測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of basal metabolic characteristic parameters of SD rats in different treatment groups

2.2 SD大鼠血清中總膽固醇和甘油三酯的變化

血清中總膽固醇和甘油三酯水平的增加，會(huì)增加血管緊張素和醛固酮的分泌[17]。SD大鼠血清中總膽固醇及甘油三酯的含量見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理組SD大鼠血清脂質(zhì)參數(shù)的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of serum lipid parameters of SD rats in different treatment groups

由圖2可知，HFHS組和HFSS組SD大鼠血清中的總膽固醇、甘油三酯含量分別為121.87mg/100mL、121.62mg/100mL和79.12 mg/100 mL、78.62 mg/100 mL，均顯著高于ND組（55.25 mg/100 mL和76.75 mg/100 mL）（P＜0.05），且HFHS組顯著高于HFSS組（P＜0.05）。結(jié)果表明，相同鹽度的醬油攝入對(duì)大鼠血清中的總膽固醇和甘油三酯具有一定調(diào)節(jié)作用。

2.3 SD大鼠血壓的變化

不同處理組SD大鼠的收縮壓變化見(jiàn)圖3。由圖3可知，各處理組SD大鼠的初始收縮壓無(wú)顯著差異（P＞0.05），灌胃第2周開(kāi)始，HFHS組SD大鼠血壓升高趨勢(shì)明顯；灌胃第4～10周，HFHS組SD大鼠血壓表現(xiàn)出持續(xù)升高的狀態(tài)，HFHS組SD大鼠血壓顯著高于HFSS組和ND組（P＜0.05），而HFSS組SD大鼠血壓與ND組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。因此，攝入釀造鮮味醬油不會(huì)引起血壓的升高。

圖3 不同處理組SD大鼠收縮壓的變化Fig.3 Changes of systolic blood pressure of SD rats in different treatment groups

2.4 SD大鼠尿液中鈉、鉀離子的濃度

腎臟在調(diào)節(jié)鈉、鉀離子平衡和血流動(dòng)力學(xué)方面起到至關(guān)重要的作用，體內(nèi)鈉離子濃度升高，鉀離子濃度降低是增加高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)的重要因素之一，有研究表明，增加飲食中鉀的攝入，可以有效改善血壓的升高[20-21]。不同處理組SD大鼠尿液中的鈉、鉀離子的質(zhì)量濃度見(jiàn)圖4。

圖4 不同處理組SD大鼠尿液中鈉離子和鉀離子質(zhì)量濃度的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of Na+and K+mass concentration in urine of SD rats in different treatment groups

由圖4可知，HFHS組和HFSS組SD大鼠尿液中的鈉離子質(zhì)量濃度分別為7 708.50 mg/L、7 652.12 mg/L，無(wú)顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于ND組（1 252.37 mg/L）（P＜0.05）。由圖4亦可知，HFHS組SD大鼠尿液中的鉀離子質(zhì)量濃度為7 542.75 mg/L，顯著低于ND組（11 479.25 mg/L）和HFSS組（10 853.50 mg/L）（P＜0.05），且ND組和HFSS組無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明相較于食鹽，釀造鮮味醬油有助于緩解食鹽引起的SD大鼠尿液中鉀離子濃度的降低，在一定程度上改善了鈉、鉀離子平衡狀態(tài)，減輕了腎臟代謝壓力，對(duì)血壓平衡的調(diào)節(jié)起到重要作用。

2.5 SD大鼠血清中血管緊張素Ⅱ和醛固酮的含量

血管緊張素與醛固酮含量的升高，會(huì)導(dǎo)致血管收縮和水鈉潴留，引起血壓上升[7]，SD大鼠血清中血管緊張素Ⅱ和醛固酮的含量見(jiàn)圖5。由圖5可知，與ND組（1 153.75 pg/mL、767.75pg/mL）相比，HFHS組（2 443.25 pg/mL、1 262.87pg/mL）和HFSS組（1 717.95 pg/mL、875.50 pg/mL）SD大鼠血清中的血管緊張素Ⅱ和醛固酮含量均升高，但HFSS組SD大鼠血清中的醛固酮含量升高不顯著（P＞0.05），且HFSS組SD大鼠血清中的血管緊張素Ⅱ和醛固酮含量均顯著低于HFHS組（P＜0.05）。結(jié)果表明，與鹽水?dāng)z入相比，醬油的攝入可以減少高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 不同處理組SD大鼠血清中血管緊張素Ⅱ和醛固酮含量的測(cè)定結(jié)果Fig.5 Determination results of serum angiotensin Ⅱand aldosterone contents in serum of SD rats in different treatment groups

2.6 SD大鼠腎臟中相關(guān)基因的表達(dá)水平

血管緊張素Ⅱ表達(dá)量增加，會(huì)刺激腎小球動(dòng)脈血管平滑肌，導(dǎo)致血管的收縮[22-23]。血管緊張素1型受體表達(dá)量增加，會(huì)介導(dǎo)大部分血管緊張素Ⅱ的反應(yīng)，如血管收縮和醛固酮水平的升高[24]。醛固酮主要作用于腎臟遠(yuǎn)端小管和集合管，影響鈉的吸收和鉀的排泄[25]。鈉鉀ATP酶α1是重要的鈉泵，可以有效的驅(qū)動(dòng)體內(nèi)的各種運(yùn)輸過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)鈉、鉀離子的運(yùn)輸，保持機(jī)體的健康[26]。不同處理組SD大鼠腎臟組織中相關(guān)基因的表達(dá)水平見(jiàn)圖6。

圖6 不同處理組SD大鼠腎臟組織中相關(guān)基因表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination results of related gene expression levels in kidney tissues of SD rats in different treatment groups

由圖6可知，HFHS組SD大鼠的血管緊張素I型受體、類固醇11β-羥化酶及醛固酮合成酶的相對(duì)信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平顯著高于ND組和HFSS組（P＜0.05），且除類固醇11β-羥化酶外，ND組和HFSS組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；HFHS組SD大鼠的鈉鉀ATP酶α1相對(duì)mRNA水平顯著低于ND組和HFSS組（P＜0.05），且ND組和HFSS組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。基因分析結(jié)果顯示，釀造鮮味醬油可以有效改善血管緊張素I型受體、類固醇11β-羥化酶、醛固酮合成酶和鈉鉀ATP酶α1基因的表達(dá)，這或許是醬油可以有效控制血壓的重要機(jī)制。

3 結(jié)論

將雄性SD大鼠隨機(jī)分成普通飲食（ND）組、高脂和高鹽飲食（HFHS）組、高脂和醬油飲食（HFSS）組，連續(xù)灌胃10周，各組SD大鼠食物攝入量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與HFHS組相比，HFSS組SD大鼠水?dāng)z入量無(wú)顯著差異（P＞0.05），體質(zhì)量、血壓顯著下降（P＜0.05），但尿液排出量顯著增加（P＜0.05）；血清中總膽固醇、甘油三酯、血管緊張素Ⅱ和醛固酮含量顯著下降（P＜0.05），尿液中的鉀離子顯著增加（P＜0.05）；腎臟中血管緊張素1型受體、類固醇11β-羥化酶及醛固酮合成酶基因的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），鈉鉀ATP酶α1基因的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明釀造鮮味醬油中雖然含有高的鹽分，但可通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)對(duì)血壓進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而維持血壓正常。