淺漬法發(fā)酵豇豆的工藝優(yōu)化

王 英，任宇杰，吳 剛，施亞萍，王 帆，劉小莉

（1.江蘇省農業(yè)科學研究院 農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京市脆而爽蔬菜食品有限公司，江蘇 南京 211225）

豇豆（Vigna unguiculata（L.）Walp.）又叫長豆角、飯豆等，富含蛋白質、胡蘿卜素、花青素等營養(yǎng)成分，口感佳，是我國南北方廣泛栽培的大眾化蔬菜之一[1-3]。嫩莢采收后因其生命活動并未停止而容易產生腐爛變質，要延長保鮮或保存期，必須采取相應的保鮮或加工手段，豇豆的加工方式主要包括腌制、脫水和制備飲料。以豇豆為原料經乳酸發(fā)酵制成的加工制品，具有多種營養(yǎng)和保健作用[4-5]。

傳統(tǒng)腌制蔬菜一般是利用高含量（＞10%）食鹽腌制，再經脫鹽、脫水、調味等一系列工序制成[6]。但是高食鹽含量帶來了許多的負面影響：首先，長期食用高鹽食品會增加心臟、腎臟的負擔，易引起心臟病、高血壓等心腦血管疾病，不利于人體的健康[7-9]；其次，傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜生產過程中產生大量高鹽含量的廢水對環(huán)境造成很大的污染，治理難度很大；再次，大量的食鹽添加也增加了發(fā)酵蔬菜的生產成本和生產周期，為本就利潤不高的發(fā)酵蔬菜產業(yè)發(fā)展造成沉重的經濟負擔[10-11]。隨著健康飲食要求的提高，腌菜應向低鹽化、低糖化、小包裝化、多元化的方向發(fā)展。國外近年來出現(xiàn)了被稱之為“淺漬菜”的低鹽浸漬菜，國內也開始了對低鹽腌制菜加工工藝及腌制過程中化學成分變化規(guī)律的研究[12-15]。

為延長豇豆產業(yè)鏈，提高豇豆加工技術，開發(fā)低鹽化發(fā)酵豇豆產品，本研究利用兩株具有抗氧化和降解亞硝酸鹽功能的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）作為復合發(fā)酵劑，研究不同的發(fā)酵條件對淺漬法發(fā)酵豇豆品質的影響，在此基礎上，利用Box-Behnken中心組合試驗對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，提高發(fā)酵豇豆的感官品質，為淺漬法發(fā)酵豇豆的工業(yè)化生產提供理論基礎和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復合發(fā)酵劑（降解亞硝酸功能植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SD-7：抗氧化功能副干酪乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FM-LP-9=1∶1）∶菌體密度為5.02×108CFU/mL，保藏于江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室。

豇豆、花椒、辣椒、冰糖、蔗糖、泡菜鹽：市售。MRS液體培養(yǎng)基和MRS固體培養(yǎng)基：青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-P5紫外分光光度計：上海美普達科技有限公司；雷磁ZD-2型自動點位滴定儀：上海精密科學儀器有限公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；YS6060色差計：深圳市三恩時科技有限公司；TMWSTOUCH質構分析儀：美國Food Technology Corporation。

1.3 試驗方法

1.3.1 淺漬發(fā)酵豇豆工藝流程及操作要點

豇豆挑選清洗→晾曬→淺漬液制備（泡菜鹽、香辛料、辣椒等）→接種發(fā)酵→泡菜汁殺菌→殺菌冷卻→成品

操作要點：

豇豆挑選、清洗與晾曬：挑選新鮮嫩脆的豇豆，用清水清洗干凈，放置在帶漏水孔的容器中進行晾曬，過程中翻動，晾曬至表面無水。

淺漬液制備：在1 L水加入45 g泡菜鹽、2 g 花椒、30 g冰糖、30 g蔗糖，煮沸后保溫10 min，降至室溫（25 ℃）備用。降溫后的淺漬液中加入0.15%的氯化鈣作為保脆劑，加入0.05%的檸檬酸和0.03%的抗壞血酸鈣作為護色劑。

接種發(fā)酵：按照淺漬液和豇豆的質量比為4∶3加入晾曬完畢的豇豆，使豇豆完全沒入淺漬液中，按照淺漬液和豇豆總質量的百分比接種發(fā)酵劑，混勻。密封后放置在一定的溫度條件下進行發(fā)酵。

泡菜汁殺菌：當pH達到3.5左右時[16]結束發(fā)酵，撈出豇豆、瀝干，淺漬液用60目篩過濾除去殘渣，加熱至90～95 ℃，放入瀝干的淺漬法發(fā)酵豇豆，30～60 s后撈出，盡可能保持泡制原味。

1.3.2 淺漬發(fā)酵豇豆工藝優(yōu)化單因素試驗

接種量對淺漬法發(fā)酵豇豆品質的影響：按照工藝流程，豇豆洗凈晾曬后加入淺漬液中，分別接種3%、4%、5%、6%、7%的復合發(fā)酵劑，在25 ℃的條件下發(fā)酵，在發(fā)酵過程中每天取樣，測定泡菜汁的pH值，當pH值達到3.5左右時結束發(fā)酵，記錄發(fā)酵結束時間，測定豇豆的硬度、色值、咀嚼性和總酸含量并對產品進行感官評價。在此基礎上，依次考察溫度（19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃和37 ℃）、發(fā)酵時間（48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h）對淺漬法發(fā)酵豇豆品質的影響。

1.3.3 淺漬發(fā)酵豇豆工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）為3個因素，利用響應面優(yōu)化試驗設計Design-Expert.8.0.6軟件Box-Behnken中心組合原理進行設計。以淺漬法發(fā)酵豇豆的硬度（Y1）和感官評分（Y2）為響應值進行3因素3水平的響應面優(yōu)化試驗，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 淺漬法發(fā)酵豇豆工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for process optimization of fermented cowpea by low-salt curing method

1.3.4 測定方法

總酸和pH值測定[17]：開始發(fā)酵后每天取5 mL的發(fā)酵水，用pH計直接測定其pH值。總酸的測定：參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中pH 計電位滴定法進行測定。

硬度和咀嚼性測定[18]：利用TMWS-TOUCH質構分析儀對淺漬法發(fā)酵豇豆進行硬度測試。

色度測定：參照文獻[19]方法測定。

感官評價：選擇對發(fā)酵蔬菜感興趣且對淺漬法發(fā)酵豇豆味道有一定識別能力的食品專業(yè)研究生10人為感官評定小組成員。對參加評定的成員事先接受訓練，明確評分標準。品嘗樣品后，溫水漱口后再品嘗下一個樣本。每一個樣本進行3次重復評定，取10人的平均分，滿分為100分。感官評分標準見表2。

表2 淺漬法發(fā)酵豇豆感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented cowpea by low-salt curing method

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)間差異比較采用t檢驗，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 接種量對淺漬法發(fā)酵豇豆發(fā)酵進程及品質的影響

豇豆在發(fā)酵過程中，經過乳酸菌代謝作用，對豇豆的質構、風味和感官有影響。陳玲等[20]對3種豇豆品種發(fā)酵后的總酸、還原糖和感官品質進行研究，發(fā)現(xiàn)各指標之間均有差異，周情操[21]發(fā)現(xiàn)湖北地區(qū)9個豇豆品種經泡制后產品風味和質構也有較大不同。這些風味和質構的不同主要受不同品種蔬菜自身的差異之外，發(fā)酵過程中微生物的生長代謝情況也對其產生影響[22-23]。接種量對豇豆酸度、硬度、色澤和感官品質的影響結果見表3。由表3可知，隨著接種量增加，總酸含量也增加，豇豆發(fā)酵周期縮短。但是，淺漬法發(fā)酵豇豆的色澤飽和度、硬度、咀嚼性和感官評分隨接種量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在接種量為5%和6%時，豇豆的感官評分、咀嚼性均最高且沒有顯著差異（P＞0.05）；在接種量為5%時，硬度和色澤飽和度顯著高于其他接種量（P＜0.05）。綜合接種量對豇豆硬度和感官評分的影響，選擇5%的接種量為宜。

表3 接種量對淺漬法發(fā)酵豇豆發(fā)酵進程及品質的影響Table 3 Effect of inoculum on fermentation process and quality of fermented cowpea by low-salt curing method

2.2 發(fā)酵溫度對淺漬法發(fā)酵豇豆發(fā)酵進程及品質的影響

PARK S E等[24]研究表明，溫度對于微生物的生長和代謝都有著重要的影響，低溫條件下微生物活性較低，代謝產物積累緩慢，產生的代謝產物也較為豐富，產品適口性較好，但發(fā)酵所需時間的較長，而發(fā)酵溫度提高能增加微生物活性有效縮短發(fā)酵時間，而代謝產物的快速積累，會造成發(fā)酵風味單一，也容易造成有機酸積累量過高，導致pH降低，降低產品適口性。發(fā)酵溫度對豇豆酸度、硬度、色澤和感官品質的影響結果見表4。由表4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，總酸含量增加，豇豆發(fā)酵周期縮短。但是，淺漬法發(fā)酵豇豆的色澤飽和度、硬度、咀嚼性和感官評分隨著發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在發(fā)酵溫度為25 ℃和28 ℃時，豇豆的色澤飽和度、咀嚼性、硬度和感官評分均最佳且沒有顯著差異（P＞0.05）；但從測定數(shù)值上看，25 ℃條件下各指標值更高一些。綜合發(fā)酵溫度對豇豆硬度和感官評分的影響，發(fā)酵溫度以25 ℃為宜。

表4 發(fā)酵溫度對淺漬法發(fā)酵豇豆發(fā)酵進程及品質的影響Table 4 Effect of fermentation temperature on fermentation process and quality of fermented cowpea by low-salt curing method

2.3 發(fā)酵時間對淺漬法發(fā)酵豇豆發(fā)酵進程及品質的影響

隨著發(fā)酵時間的延長，有機酸和代謝產物濃度及種類增多，對產品的品質產生不同影響[25-28]，同樣有研究表明，在不同的發(fā)酵時間點，產品的色澤有著明顯的差異，尤其是在發(fā)酵初期色澤的變化尤為明顯[29]。本研究中發(fā)酵時間對豇豆酸度、硬度、色澤和感官品質的影響結果見表5。隨著發(fā)酵時間的延長，總酸含量增加，發(fā)酵豇豆的色澤、飽和度、硬度和咀嚼性呈現(xiàn)下降趨勢，在發(fā)酵時間為96 h和120 h時，色澤飽和度、硬度和咀嚼性之間沒有顯著差異（P＞0.05）。感官評分隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在發(fā)酵120 h時感官評分值最高。感官評分時包括色澤、質地、滋味多種指標，而硬度主要體現(xiàn)為質地變化。因此綜合發(fā)酵時間對豇豆硬度和感官評分的影響，發(fā)酵時間以120 h為宜。

表5 發(fā)酵時間對淺漬法發(fā)酵豇豆發(fā)酵進程及品質的影響Table 5 Effect of fermentation time on fermentation process and quality of fermented cowpea by low-salt curing method

2.4 淺漬法發(fā)酵豇豆發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗結果

利用軟件對表6數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到發(fā)酵豇豆硬度預測值（Y1）對A、B和C的二次多項回歸方程：Y1=47.32-0.74A-2.72B-4.56C+0.50AB-0.58AC-0.30BC-5.25A2-4.27B2-3.98C2；得到發(fā)酵豇豆感官評分預測值（Y2）對A、B和C的二次多項回歸方程Y2=90.07+3.31A+1.66B+5.45C+0.33AB-1.75AC-0.59BC-3.40A2-4.19B2-8.88C2。

表6 淺漬法發(fā)酵豇豆工藝優(yōu)化響應面試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of response surface test for process optimization of fermented cowpea by low-salt curing method

由表7可知，該模型的F值為134.04，P＜0.000 1，說明該模型極顯著，且失擬項不顯著（P＞0.05），說明方程具有良好的擬合性和實用性，試驗誤差較小。另外，該模型的決定系數(shù)R2=0.991 8，校正決定系數(shù)R2Adj=0.984 4，說明該模型能解釋98.44%的淺漬法發(fā)酵豇豆硬度的變化。各因素對淺漬發(fā)酵豇豆硬度的變化的貢獻大小順序為發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞接種量。由回歸方差分析可知，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對淺漬發(fā)酵豇豆硬度的變化的影響有極顯著的影響（P＜0.01）。接種量對淺漬法發(fā)酵豇豆硬度變化的影響有顯著的影響（P＜0.05）。從以感官評分響應值的回歸模型方差分析結果（表8）可知，該模型的F值為80.55，P＜0.000 1，說明該模型極顯著（P＜0.01）；且失擬項不顯著（P＞0.05），說明方程具有良好的擬合性和實用性，試驗誤差較小。另外，該模型的決定系數(shù)R2=0.986 4，校正決定系數(shù)R2Adj=0.974 1，說明該模型能解釋97.41%的淺漬法發(fā)酵豇豆感官評分的變化。各因素對淺漬法發(fā)酵豇豆感官評分的變化的貢獻大小順序為發(fā)酵時間＞接種量＞發(fā)酵溫度。由回歸方差分析可知，接種量和發(fā)酵時間對淺漬法發(fā)酵豇豆感官評分的變化的影響有極顯著的影響（P＜0.01）。發(fā)酵溫度對淺漬法發(fā)酵豇豆感官評分的變化的影響有顯著的影響（P＜0.05）。

表7 以硬度為響應值的回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model with hardness as response value

表8 以感官評分為響應值的回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model with sensory score as response value

用Design Expert 8.0.6軟件做出兩因子交互作用顯著的響應面及其等高線，接種量和發(fā)酵溫度的交互作用見圖1。從圖1可以看出，發(fā)酵時間從96 h增至144 h時，接種量從4%增至6%，發(fā)酵豇豆的感官評分呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，曲面的定點為發(fā)酵豇豆感官評分的最大值。從等高線圖中可以看出，發(fā)酵溫度和接種量交互作用顯著（P＜0.05）。

圖1 接種量與發(fā)酵時間交互作用對淺漬法發(fā)酵豇豆感官評分影響的響應曲面與等高線Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between inoculum and fermentation time on sensory score of fermented cowpea by low-salt curing method

2.5 模型驗證

由感官評分的模型可得最佳發(fā)酵條件的預測值為發(fā)酵溫度25.12 ℃，接種量5.15%，發(fā)酵時間125 h，在此條件下發(fā)酵豇豆硬度理論值為47.3 N，感官評分的理論值為91.21分。為方便實際操作，修改發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度25 ℃，接種量5%，發(fā)酵時間125 h，為證實預測結果，在此條件下進行3次重復試驗，得到的發(fā)酵豇豆硬度實際值47.31 N，感官評分實際值為90.98分，與預測值接近，說明該試驗模型可操作性高。

3 結論

通過單因素試驗及響應面試驗獲得豇豆淺漬發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵溫度25 ℃，接種量5%，發(fā)酵時間125 h，在此條件下得到的淺漬法發(fā)酵豇豆的硬度為47.31 N，感官評分為90.98分，回歸分析和驗證試驗都表明該試驗模型的合理性和可行性，研究結果為淺漬法發(fā)酵豇豆提供技術支持和科學依據(jù)，在豇豆的發(fā)酵腌制生產過程中避免了高鹽廢水的大量產生。