烤煙植株磷對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)的影響及調(diào)控途徑

潘曉英，陳俊標(biāo)，李集勤，馬柱文，徐婷裕，楊少海，黃振瑞

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省煙草育種與綜合利用工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510640）

煙草不僅是科學(xué)研究領(lǐng)域的重要模式植物，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)的種植面積約有100萬hm2。在生產(chǎn)上通常采取打頂和控制腋芽發(fā)生，使煙株在后期生長(zhǎng)過程中將能量轉(zhuǎn)移至葉片，促進(jìn)煙葉產(chǎn)量最大化[1–2]。氮、磷和鉀的供應(yīng)在煙株的栽培過程中起著非常重要的作用。磷對(duì)煙葉成熟期的色澤形成以及烤后的煙葉品質(zhì)具有重要影響，缺磷會(huì)延緩煙葉的成熟，并降低葉片中氮和鎂的濃度[3]。過量供磷通常不會(huì)增加產(chǎn)量，反而會(huì)降低煙葉質(zhì)量，出現(xiàn)葉片干燥和不規(guī)則的葉片形態(tài)[4]。過量施用磷肥還會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染與中微量元素缺乏等問題[5–6]。因此，探究煙株生長(zhǎng)過程中磷養(yǎng)分的分配規(guī)律，對(duì)實(shí)現(xiàn)煙葉生產(chǎn)的高產(chǎn)高效具有重要意義。

植物體內(nèi)養(yǎng)分間的關(guān)系十分復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在長(zhǎng)期缺磷或低磷脅迫條件下，葉片中的鉀濃度顯著降低，并誘導(dǎo)編碼鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的上調(diào)表達(dá)[7]。同樣，在低鉀的生長(zhǎng)環(huán)境下，煙株體內(nèi)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因也顯著上調(diào)[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，增加鈣養(yǎng)分的施用會(huì)降低煙株體內(nèi)磷養(yǎng)分的濃度[9–10]。其次，磷養(yǎng)分與其他微量元素之間也存在復(fù)雜的交互作用。首先，磷和鋅養(yǎng)分之間的交互作用研究較多。供磷水平增加會(huì)導(dǎo)致鋅含量降低，如在小麥、玉米、大豆、棉花和番茄等多種作物中，隨著磷肥施用量增加，作物體內(nèi)磷濃度升高，但鋅濃度顯著降低[11–14]。而大麥的相關(guān)研究中，在正常供磷和低磷條件下，缺鋅會(huì)上調(diào)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[15]。雖然錳是一種類似于鋅的二價(jià)陽(yáng)離子，但研究發(fā)現(xiàn)，磷會(huì)促進(jìn)番茄對(duì)錳的吸收[11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，缺磷處理會(huì)導(dǎo)致幼苗期的擬南芥和水稻體內(nèi)鐵養(yǎng)分積累[7, 16–17]。缺磷會(huì)誘導(dǎo)大豆體內(nèi)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的上調(diào)表達(dá)[18]。這些結(jié)果綜合表明，植物體內(nèi)磷養(yǎng)分與其他養(yǎng)分之間存在復(fù)雜的交互作用，且磷養(yǎng)分與其他養(yǎng)分交互作用情況存在物種差異性。更重要的是，煙草中磷養(yǎng)分與其他養(yǎng)分的交互作用以及分子水平的相關(guān)研究尚未見具體報(bào)道。

鑒于磷在煙株生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要作用，解析煙株體內(nèi)磷營(yíng)養(yǎng)分配規(guī)律及其與其它養(yǎng)分間的交互作用，為磷肥配合其他養(yǎng)分施用提供理論基礎(chǔ)具有重要意義。本研究通過不同供磷處理，解析低磷與過量供磷對(duì)煙株體內(nèi)的磷以及其它養(yǎng)分的濃度、含量以及分配規(guī)律的影響。其次，我們結(jié)合前期已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出86個(gè)養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因在啟動(dòng)子區(qū)域（2 kb）含P1BS轉(zhuǎn)錄元件，并對(duì)其中12個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。此外，我們結(jié)合分子生物學(xué)方法，鑒定到鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因受NtPHR2的直接調(diào)控。本研究結(jié)果將為改進(jìn)煙葉生產(chǎn)中磷肥施用的管理策略提供理論基礎(chǔ)，以最大限度地提高煙葉生產(chǎn)水平。

1 材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)與生長(zhǎng)條件

供試材料為我國(guó)的煙草主栽品種K326 (Nicotiana tabacumL. cv. K326)。將 K326 包衣種子播入泥炭、蛭石、珍珠巖(3∶1∶1, V∶V∶V)混合基質(zhì)的漂浮苗盤中進(jìn)行育苗，培養(yǎng)60天挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯煙苗，去除根部雜質(zhì)，移栽至容量為4 L的塑料花盆，容器下部有孔，以便多余的水分漏出，底部墊尼龍網(wǎng)，防止漏砂。盆內(nèi)含2 L石英砂(0.1%的鹽酸浸泡后去離子水洗晾干)，粒徑為0.2～0.4 mm，表面覆蓋一層陶粒，保持水分并避免產(chǎn)生綠藻。植物生長(zhǎng)室條件：日光溫室，晝夜溫差為22℃～30℃。

培養(yǎng)過程中澆Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，具體配方為：3 mmol/L KNO3、2 mmol/L Ca (NO3)2、1 mmol/L KH2PO4、0.25 mmol/L MgSO4、25 μmol/L KCl、12.5 μmol/L H3BO3、1 μmol/L MnSO4、1 μmol/L ZnSO4、0.25 μmol/L CuSO4、0.25 μmol/L (NH4)6Mo7O24和 0.1 mmol/L Fe-EDTA。因此，對(duì)照條件磷濃度為1 mmol/L KH2PO4。低磷處理中磷濃度為 0.1 mmol/L KH2PO4，其余鉀離子由KCl替代補(bǔ)齊。高磷處理中磷濃度為 5 mmol/L NaH2PO4，缺失的鉀由 KCl替代補(bǔ)齊。移栽后，澆1/4的營(yíng)養(yǎng)液300 mL，隔天澆一次。培養(yǎng)至7天，隔天澆1/2的營(yíng)養(yǎng)液300 mL。培養(yǎng)至14天，澆全營(yíng)養(yǎng)液，每天澆一次500 mL，每次澆完?duì)I養(yǎng)液將滲出的液體倒掉。每周澆一次去離子水1 L (避免鹽害)。培養(yǎng)至28天開始不同供磷處理，每個(gè)處理7盆。培養(yǎng)至35天對(duì)煙株進(jìn)行打頂(模擬生產(chǎn)實(shí)踐)后繼續(xù)培養(yǎng)至42天收獲樣品，收獲前拍照記錄。

1.2 樣品收獲與養(yǎng)分測(cè)定

收獲提取總RNA樣品：將煙株的根、莖、葉和腋芽，用鋁箔紙包裹后立即在液氮中速凍，隨后保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

收獲用于測(cè)定養(yǎng)分濃度的樣品：根、上部葉(從上往下4片葉)、下部葉(除去上部4片葉的全部葉片)、上部莖(上部葉對(duì)應(yīng)的莖部)、下部莖(下部葉對(duì)應(yīng)的莖部)、腋芽，分別用自來水洗滌，再用去離子水洗滌后放入烘箱(105℃)殺青0.5 h后，65℃烘干至恒重，稱重記錄，隨后用不銹鋼粉樣機(jī)磨碎用于測(cè)定養(yǎng)分含量。

樣品分析時(shí)，首先加入HNO3–H2O2，用微波消解儀 (CEM, Matthew, NC, USA)對(duì)樣品進(jìn)行消解。然后運(yùn)用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES, OPTIMA 3300 DV, Perkins-Elmer, USA)對(duì)消解液中的養(yǎng)分濃度進(jìn)行測(cè)定。整個(gè)分析過程中，用標(biāo)準(zhǔn)樣品IPE684和IPE126對(duì)消解過程和測(cè)定過程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

1.3 啟動(dòng)子序列中含有磷調(diào)控順式元件P1BS的基因鑒定

基于本團(tuán)隊(duì)前期已積累的根部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(PRJNA 649315)，運(yùn)用自定義Perl腳本在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb序列區(qū)域內(nèi)，搜索磷調(diào)控順式元件P1BS(5′–GNATATNC–3′)，統(tǒng)計(jì)分析其數(shù)量和所在位置[19]。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(RT-qPCR)

RNA提取采用Trizol法(Invitrogen)。隨后，運(yùn)用 Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time, Takara)進(jìn)行 cDNA 合成。合成的cDNA 經(jīng)過 5 倍稀釋后體積為 100 μL，取 2 μL 用于25 μL體系PCR反應(yīng)。基因特異性引物見附表1。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min，40個(gè)循環(huán)程序 (95℃ 變性 15 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s)[20]。數(shù)據(jù)處理運(yùn)用比較CT值法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[21]。每個(gè)處理至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，采用泛素連接酶基因(evm.TU.HIC_ASM_12.2258)為內(nèi)參對(duì)照。

1.5 酵母單雜與原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化、EMSA

首先，酵母單雜部分，運(yùn)用附表1的引物構(gòu)建pAbAi酵母重組質(zhì)粒，測(cè)序后利用BstBI線性化載體轉(zhuǎn)入Y1HGold菌株，獲得重組酵母菌。涂布于SD/-Ura/AbAn上篩選抑制各個(gè)酵母菌生長(zhǎng)的金擔(dān)子素(aureobasidin A，簡(jiǎn)稱AbA)最低濃度。進(jìn)一步利用重組酵母菌株制備感受態(tài)，并將NtPHR2-pGADT7(NtPHR2-AD) 轉(zhuǎn)化感受態(tài)。得到含有靶基因和順式元件的重組酵母菌，涂布于含有相應(yīng)AbA背景濃度的培養(yǎng)基SD/-Leu/AbAn上，30℃倒置培養(yǎng)觀察。其次，進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化與雙熒光素酶(dual luciferase reporter gene assay, LUC)分析，

將NtPHR2的編碼序列克隆到載體pGreen ∥ 62-SK (效應(yīng)子，effector)中，同時(shí)將靶基因的～1500-bp 啟動(dòng)子序列克隆到載體 pGreen II 0800-LUC (報(bào)告子，reporter)中，測(cè)序驗(yàn)證后，共轉(zhuǎn)原生質(zhì)體。同時(shí)以 pGreen ∥ 62-SK (效應(yīng)子，effector)空載體與連接靶基因啟動(dòng)子的 pGreen II 0800-LUC (報(bào)告子，reporter)重組載體共轉(zhuǎn)原生質(zhì)體作為對(duì)照。后續(xù)實(shí)驗(yàn)運(yùn)用酶標(biāo)儀，參考本小組原有的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定螢火蟲螢光素酶(LUC)和海腎螢光素酶(REN)的活性，計(jì)算LUC/REN值，具體步驟參見相關(guān)文獻(xiàn)[22]。

將重組載體PET28a-NtPHR2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行蛋白表達(dá)并純化(Ni-NTA 純化樹脂預(yù)裝柱C600791/C600793購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)。隨后進(jìn)行探針準(zhǔn)備，凝膠制備與跑膠，轉(zhuǎn)膜與交聯(lián)。最后進(jìn)行膜封閉、抗體孵育以及顯色曝光獲取圖片等，按照試劑盒[LightShift?Chemiluminescent EMSA Kit (20148)與 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module (89880)購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific]進(jìn)行[22]。具體采用的引物和探針序列見附表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析，采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(SAS Institute Inc., 2001)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷與過量供磷顯著抑制煙株生長(zhǎng)

圖1結(jié)果顯示，與對(duì)照條件和高磷處理相比，低磷處理的煙株葉片淺綠，葉片較小且下部葉明顯衰老(圖1A)。其次，低磷處理的煙株根系生物量明顯偏少(圖1B)。

圖1 不同供磷水平下烤煙地上部和根系Fig. 1 The shoot and root of tobacco under different P supply levels

煙株收獲后，對(duì)其干物質(zhì)量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，低磷顯著抑制根部干物質(zhì)量累積，但過量供磷并未增加根部干物質(zhì)量(表1)。除莖和下部葉片外，低磷和過量供磷條件下的上部葉和腋芽干物質(zhì)量累積顯著低于對(duì)照條件下(表1)。以上結(jié)果表明，不同供磷水平，顯著影響煙株根部和地上部干物質(zhì)量。低磷向優(yōu)化施磷(對(duì)照)的過程中，植株的干物質(zhì)量呈顯著增加的趨勢(shì)，但過量施磷不會(huì)導(dǎo)致干物質(zhì)量的進(jìn)一步增加，反而會(huì)抑制煙株發(fā)育以及地上部干物質(zhì)量累積。

表1 不同供磷水平下煙株各組織器官與整株干物質(zhì)量 (g)Table 1 Dry matter of tobacco plant parts under differential P supply levels

2.2 供磷水平對(duì)煙株磷及其他礦質(zhì)元素濃度的影響

隨著供磷水平從低(LP)、正常(對(duì)照)到高(HP)，煙株體內(nèi)各組織器官中的磷濃度顯著提高(圖2)，只有腋芽組織中，低磷條件下的磷含量高于對(duì)照，這可能是由于磷從其他部位向幼嫩部位(營(yíng)養(yǎng)中心)轉(zhuǎn)運(yùn)增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，低磷和高磷處理下的根系鉀濃度均低于對(duì)照煙株根系，但地上部各組織，高磷處理時(shí)鉀濃度隨之升高，包括下部莖和上部莖、下部葉片和上部葉片以及腋芽組織。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)低磷處理煙株的根系和地上部葉片中的鈣濃度低于對(duì)照煙株。低磷處理的煙株根系和葉片（下部和上部）中鎂濃度低于對(duì)照煙株，但高磷不會(huì)降低煙株地上部組織中的鎂濃度，且發(fā)現(xiàn)高磷處理的煙株上部葉片和腋芽組織中鎂濃度高于對(duì)照煙株（圖2）。

圖2 不同供磷水平下煙株磷、鉀和鈣、鎂養(yǎng)分濃度Fig. 2 Concentrations of P, K, Ca and Mg in tobacco plant under different P supply levels

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低磷和高磷處理根系的微量元素鐵、銅和鋅濃度與對(duì)照無顯著差異。低磷處理下煙株根系中錳濃度低于對(duì)照及高磷煙株。低磷和高磷處理的煙株地上部葉片中鐵、鋅和錳的濃度均低于對(duì)照煙株，但銅濃度在對(duì)照和高磷處理間無顯著差異（圖3）。

圖3 不同供磷水平下煙株微量元素濃度Fig. 3 Micronutrient concentrations in tobacco plant under different P supply levels

2.3 供磷水平對(duì)煙株體內(nèi)磷與其他礦質(zhì)元素分配的影響

從表2結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，提高供磷水平顯著降低了地上部磷元素的分配。與對(duì)照和高磷處理相比，低磷處理根系中鈣、錳和鋅的分布顯著降低，表明常規(guī)和高磷處理促進(jìn)了鈣、錳和鋅向地上部的轉(zhuǎn)移。低磷和高磷處理均會(huì)促進(jìn)鎂和鉀向地上部轉(zhuǎn)移。供磷水平對(duì)鐵和銅元素的分配沒有顯著影響。

表2 不同供磷水平下煙株各組織器官中養(yǎng)分的分配率(%)Table 2 Distribution percentage of a nutrient in tobacco plant parts as affected by Papplication levels

2.4 啟動(dòng)子區(qū)域具有P1BS順式作用元件的礦質(zhì)養(yǎng)分吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因篩選及其驗(yàn)證

低磷處理時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的系統(tǒng)信號(hào)以維持磷穩(wěn)態(tài)，PHR是這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵中心轉(zhuǎn)錄因子，主要通過與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的P1BS(5′-GNATATNC-3′)順式作用元件結(jié)合調(diào)控其表達(dá)[23]。根中基因表達(dá)對(duì)磷營(yíng)養(yǎng)變化的響應(yīng)比地上部敏感，因此，我們運(yùn)用前期已有根部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選啟動(dòng)子區(qū)域具有P1BS順式作用元件的基因。

經(jīng)分析，煙株根部有12,850個(gè)基因在上游啟動(dòng)子2 kb序列中具有P1BS順式作用元件，從中篩選出與養(yǎng)分吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因86個(gè)(附表2)。從中挑選出12個(gè)磷、鉀、鈣、鎂以及鐵、銅和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，分析它們?cè)诓煌┝姿教幚淼母到M織中的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中兩個(gè)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在低磷和高磷處理時(shí)，均上調(diào)表達(dá)(圖4A、B)。在低磷和高磷處理時(shí)，兩個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因均上調(diào)表達(dá)(圖4C、D)。鈣和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在低磷或高磷處理時(shí)，表達(dá)量上調(diào)(圖4E—G)。此外，其中的兩個(gè)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，在低磷和高磷處理時(shí)，表達(dá)量也上調(diào)(圖4H、I)。其中一個(gè)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在低磷處理時(shí)上調(diào)表達(dá)，在高磷處理時(shí)下調(diào)表達(dá)(圖4J)。在低磷和高磷處理時(shí)，其中一個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)上調(diào)，而另一個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)量下降(圖 4K、L)。

圖4 熒光定量PCR驗(yàn)證附表2中選取的12個(gè)基因?qū)Φ土缀透吡椎捻憫?yīng)Fig. 4 RT-qPCR validation of expression levels of twelve selected genes in response to LP and HP

2.5 NtPHR2可直接調(diào)控鉀和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

鉀和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是否受NtPHR2直接調(diào)控，依次通過酵母單雜、原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，隨后設(shè)計(jì)生物素標(biāo)記探針進(jìn)行凝膠阻滯試驗(yàn)(EMSA)，從體外證明NtPHR2能直接結(jié)合到鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(K+transporter/evm.TU.HIC_ASM_15.653)和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子 (CorA-like Mg2+transporter protein/evm.TU.HIC_ASM_3.60)(圖5)。因此，本研究結(jié)果證明，NtPHR2通過結(jié)合P1BS順式元件直接調(diào)控鉀和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

3 討論

3.1 缺磷與過量供磷抑制煙株生長(zhǎng)和地上部生物量積累

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)煙株對(duì)供磷水平非常敏感，低磷和高磷處理均顯著降低煙株地上部干物質(zhì)量的累積，但高磷處理時(shí)，煙株根系干物質(zhì)量與對(duì)照無顯著差異(表1)。正如我們預(yù)期，煙株對(duì)磷的吸收以及向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)量隨供磷水平增加而增加(圖2)，且過量供磷導(dǎo)致根系磷累積量的增加可能具有降低根系活力的毒性效應(yīng)[11]。與已有田間試驗(yàn)結(jié)果一致，小麥地上部生物量積累隨著施磷量的增加而增加，但過量施磷不會(huì)導(dǎo)致生物量的進(jìn)一步增加[14]。

3.2 煙株體內(nèi)磷養(yǎng)分與其他礦質(zhì)養(yǎng)分之間存在廣泛的交互作用

在此研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著供磷水平增加，煙株體內(nèi)磷與其他礦質(zhì)養(yǎng)分濃度與交互作用隨之發(fā)生變化。同時(shí)，不同供磷水平對(duì)不同礦質(zhì)養(yǎng)分的影響并不一致。

烤煙中鉀的含量是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。我們的研究結(jié)果表明，高磷條件下煙株葉片中鉀濃度高于對(duì)照和低磷(圖2)。同時(shí)，低磷和高磷條件下根系中鉀的分配比例變低(表2)，表明低磷與過量供磷均會(huì)促進(jìn)鉀從根系向地上部轉(zhuǎn)移。此外，煙株中鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子中具有P1BS順式調(diào)控元件(附表2)，同時(shí)，其中兩個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因均上調(diào)表達(dá)(圖4C、D)，并有試驗(yàn)證明其中一個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因受到NtPHR2的直接調(diào)控(圖5A)。這些結(jié)果綜合表明，煙株中鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接響應(yīng)磷脅迫，存在較強(qiáng)的交互作用。這與其他作物中的研究結(jié)果一致，包括水稻中鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因受到低磷脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[7]，以及煙株中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在缺鉀條件下顯著上調(diào)，包括PHO1、PHT1;8、PHT1;9和PHT4;5[8]。

與鉀的研究結(jié)果一致，高磷條件下的煙株葉片中鎂濃度高于對(duì)照，低磷條件下煙株葉片中鎂濃度最低。此外，我們篩選到11個(gè)鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有P1BS順式調(diào)控元件(附表2)，同時(shí)，RT-qPCR分析驗(yàn)證其中兩個(gè)鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，分別在低磷或高磷處理時(shí)，表達(dá)量上調(diào)(圖4F、G)，其中一個(gè)鎂轉(zhuǎn)白蛋白基因受到NtPHR2的直接調(diào)控(圖5B)，進(jìn)一步說明磷和鎂之間存在直接的交互作用。磷和鈣是不相容離子，鈣可與磷及其衍生物形成不溶性化合物參與協(xié)調(diào)磷脅迫反應(yīng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，施用鈣肥會(huì)促進(jìn)煙株葉片中鈣濃度升高，但會(huì)導(dǎo)致煙株中磷由根部向地上部葉片中的分配降低[10–11]。與此研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示低磷脅迫降低煙株根部和上部葉片中鈣濃度，并促進(jìn)鈣從根部向地上部轉(zhuǎn)移(圖2和表2)。同時(shí)，高磷處理也降低煙株體內(nèi)上部葉片的鈣濃度(圖3)。其次，我們也篩選到14個(gè)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因具有P1BS順式作用元件，并驗(yàn)證其中鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(evm.TU.HIC_ASM_20.3333)在低磷和高磷條件下顯著上調(diào)(圖4E)，綜合表明磷和鈣相互作用調(diào)節(jié)養(yǎng)分水平參與煙株發(fā)育過程。實(shí)際上鎂作為幾種激酶的激活劑，能激活大部分涉及磷酸鹽轉(zhuǎn)移的反應(yīng)[24]。并且從植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度看，鎂從根部到地上部的轉(zhuǎn)移依賴磷的供應(yīng)[25]。研究也表明大豆中磷能促進(jìn)鎂的吸收，磷鎂存在互作，并受到大豆的基因型影響[26]。花生中的研究也表明，磷鈣合理配施可提高花生磷鈣吸收效率[27]。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，進(jìn)行磷肥、鎂肥和鈣肥的合理配合施用，更有利于煙草高產(chǎn)高效的栽培。

圖5 NtPHR2直接結(jié)合于鉀和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子中P1BS元件Fig. 5 NtPHR2 directly binds toP1BS in the promoter of K and Mg transporter genes

值得關(guān)注的是，不合理的供磷量也會(huì)顯著影響煙株體內(nèi)微量元素的濃度。在小麥、玉米、大豆、棉花和番茄的相關(guān)研究結(jié)果中顯示，施磷量與磷濃度呈正相關(guān)，但與地上部鋅濃度呈負(fù)相關(guān)[12–15]。但研究結(jié)果也顯示，在不同物種不同生育期養(yǎng)分之間的交互作用表現(xiàn)并不完全相同。在本研究中，鐵、鋅和錳養(yǎng)分在地上部組織器官中受不同供磷水平影響表現(xiàn)相似。與對(duì)照相比，低磷和高磷處理的煙株上部葉片中鋅和錳濃度均顯著降低(圖3)。低磷脅迫促進(jìn)鋅和錳由根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)(表2)。同時(shí)，我們篩選到13個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有P1BS順式作用元件(附表2)，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其中兩個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因受到低磷與高磷的顯著調(diào)控(圖4K、L)，進(jìn)一步說明煙株中磷與鋅元素間存在交互作用。前人在大麥的研究中發(fā)現(xiàn)，缺鋅會(huì)誘導(dǎo)低磷和對(duì)照條件下的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)地上部磷累積[16]。在番茄的研究中發(fā)現(xiàn)施磷會(huì)促進(jìn)錳的吸收[12]，這與我們研究結(jié)果相反，再次表明各元素間的交互作用存在物種特異性。此研究結(jié)果將提示我們，與其他物種的響應(yīng)不同，煙草中磷與錳元素存在拮抗作用，所以在煙草種植過程中，提高磷施用量可能會(huì)降低煙株錳的吸收。此外，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，低磷和高磷處理的煙株上部葉片的鐵濃度降低(圖3)。我們鑒定到4個(gè)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有P1BS順式調(diào)控元件(附表2)，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩個(gè)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，在低磷和高磷處理時(shí)，表達(dá)量顯著上調(diào)(圖4H、I)。這些結(jié)果說明磷和鐵在煙株中存在強(qiáng)烈的交互作用，磷養(yǎng)分失調(diào)將導(dǎo)致煙株缺鐵，可能促進(jìn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量上調(diào)。但在擬南芥和水稻幼苗期，缺磷會(huì)導(dǎo)致鐵養(yǎng)分的顯著累積[8,17–18]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)缺磷脅迫條件下，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtIRT1表達(dá)下降，通過生理數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)這與缺磷植株中鐵濃度增加有關(guān)[28]。因此，煙株種植過程中，磷肥正常施用范圍內(nèi)，可促進(jìn)鐵的吸收，過量供磷脅迫可能對(duì)鐵吸收利用造成干擾，將導(dǎo)致煙株出現(xiàn)鐵吸收下降的現(xiàn)象。最后，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，低磷處理的煙株地上部葉片的銅濃度降低(圖3)，且發(fā)現(xiàn)部分銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有P1BS順式調(diào)控元件(附表2)并受到低磷和高磷的差異調(diào)控(圖4J)。與此結(jié)果一致的是缺磷增加了大豆中銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)[19]。

4 結(jié)論

我們的研究結(jié)果證明，除鉀和鎂外，煙株上部葉片中礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收受到過量供磷的負(fù)面影響，這些元素的調(diào)控基因?qū)θ绷缀土走^量均有一定的響應(yīng)。結(jié)合已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們采用篩選順式調(diào)控元件(P1BS)和RT-qPCR驗(yàn)證，鑒定到受NtPHR2基因直接調(diào)控的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，磷對(duì)其他礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收利用的影響不僅限于土壤和根系。

附表 1 本研究中使用的引物序列Supplyment table 1 Primers used in this study

附表 2 含有P1BS順式調(diào)控元件并參與礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Supplyment table 2 List of genes harboredP1BS motif and involved in uptake and translocation of the mineral nutrients

續(xù)附表 2 Table 2 continued