法夫酵母高產(chǎn)蝦青素發(fā)酵工藝的建立

梁玲玲，徐作武，盧越巧，楊一恭，劉燕，邵東，陳克杰 (浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 紹興 312500)

0 引言

蝦青素 (Astaxanthin)被譽(yù)為“超級(jí)維生素E”，在延緩衰老，提高免疫，防治腫瘤、心血管疾病和糖尿病等方面有顯著作用[1]。蝦青素微生物生產(chǎn)系統(tǒng)已成為現(xiàn)今主要的商業(yè)生產(chǎn)方式，相比不同蝦青素生產(chǎn)菌株，法夫酵母具有以下優(yōu)勢(shì)：(1) 無(wú)需光照，不受地理限制，易于產(chǎn)業(yè)化；(2) 可利用多種糖進(jìn)行快速異養(yǎng)代謝、培養(yǎng)時(shí)間短[2]；(3) 菌體濃度高，進(jìn)一步提升潛能大；(4)非轉(zhuǎn)基因，且已獲中國(guó)農(nóng)業(yè)部和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 批準(zhǔn)用作動(dòng)物飼料添加劑，安全可靠[3-4]。本研究圍繞菌濃和產(chǎn)量這兩個(gè)基本出發(fā)點(diǎn)，以本司保藏的高產(chǎn)菌株法夫酵母XC3015為研究對(duì)象，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)發(fā)酵配方進(jìn)行優(yōu)化，在補(bǔ)料搖瓶上考察碳源補(bǔ)加工藝，并在70 L發(fā)酵罐上進(jìn)行新工藝驗(yàn)證，初步建立了適合該菌株的蝦青素高產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

法夫酵母 (Phaffia rhodozyma) XC3015

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 培養(yǎng)基的配制

固體培養(yǎng)基：YM培養(yǎng)基，成份參考文獻(xiàn)[5]，加入20 g/L瓊脂，調(diào)pH值為6.0，121 ℃滅菌30 min。種子培養(yǎng)基：YM培養(yǎng)基，調(diào)pH值為6.0，121 ℃滅菌30 min。

初始發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖 7.5 g/L、麥芽糊精 7.5 g/L、糖 蜜 5.0 g/L、(NH4)2SO43.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl2·2H2O 0.1 g/L、酵母抽提物 1.0 g/L、乳酸 5.0 g/L、維生素溶液1 mL/L、金屬溶液 1 mL/L、泡敵 0.1 g/L，調(diào)pH值為6.0，121 ℃滅菌30 min。

維生素溶液：泛酸鈣 5.2 g/L、生物素 0.13 g/L、 肌醇 66.67 g/L、尼克酸 5.2 g/L、對(duì)氨基苯甲酸 0.53 g/L、VB62.67 g/L、VB12.67 g/L、核黃素 5.2 g/L。金 屬 溶 液：H3BO32.67 g/L、CuSO4·5H2O 1.6 g/L、KI 0.27 g/L、MnCl2·4H2O 2.70 g/L、Na2MoO4·2H2O 1.07 g/L、ZnSO4·7H2O 24 g/L、CoCl2·6H2O 0.8 g/L、檸檬酸鐵 24 g/L。發(fā)酵補(bǔ)糖培養(yǎng)基：葡萄糖 175 g/L、麥芽糊精 175 g/L、糖蜜 50 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

(2) 培養(yǎng)方法

固體培養(yǎng)：取-80 ℃冰箱保藏的冷凍甘油保藏液，融化后稀釋適當(dāng)倍數(shù)取0.1 mL涂布平板，平板置于20.5 ℃下恒溫培養(yǎng)5~7天。種子瓶培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取生長(zhǎng)良好的單菌落，接種種子培養(yǎng)基 (10 mL/50 mL試管)，于20.5 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，獲得成熟一級(jí)種子培養(yǎng)液。取2.5 mL一級(jí)種子培養(yǎng)液二次接種子培養(yǎng)基 (22.5 mL/250 mL 三角瓶)，于20.5 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h，獲得成熟種子瓶培養(yǎng)液。發(fā)酵瓶培養(yǎng)：取成熟種子瓶培養(yǎng)液按10%接種比例接發(fā)酵培養(yǎng)基(45 mL /650 mL三角瓶)，于20.5 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)120 h，放瓶。補(bǔ)料搖瓶培養(yǎng)：取成熟種子瓶培養(yǎng)液按10%接種比例接發(fā)酵培養(yǎng)基 (250 mL/1 000 mL補(bǔ)料搖瓶)，發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)程序設(shè)計(jì)自動(dòng)補(bǔ)加碳源，控制pH值為5.00±0.02，在通氣比1 vvm、溫度20±0.5 ℃、轉(zhuǎn)速 220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)165~175 h。30 L種子罐培養(yǎng)：取二級(jí)成熟種子瓶培養(yǎng)液，按1.0%接種比例接種子培養(yǎng)基 (20 L/30 L種子罐)，于溫度20.5±0.2 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min、通氣量比1.5 vvm、罐壓0.06 MPa條件下培養(yǎng)40 h。70 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：將成熟種子罐培養(yǎng)液按10%移種比例移發(fā)酵罐 (25 L/70 L發(fā)酵罐)，培養(yǎng)溫度20.5±0.2 ℃、通氣比0.6～1.5 vvm、罐壓0.06 MPa，全程用25%～28%氨水控制pH值為5.00±0.02，攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，關(guān)聯(lián)值為40%。定期取樣測(cè)定菌濃、碳源濃度和蝦青素產(chǎn)量。

(3)發(fā)酵優(yōu)化方法

發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶正交優(yōu)化：選取酵母抽提物、碳源 (葡萄糖：麥芽糊精：糖蜜=3:3:2)、蛋白胨、(NH4)2SO4、微量元素 (維生素溶液：金屬溶液=1:1)、乳酸和KH2PO4這7種主要培養(yǎng)基組份，作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素。試驗(yàn)采用7因素3水平正交試驗(yàn)L18(37)，分析它們對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響。

(4)測(cè)定方法

菌體濃度檢測(cè)：對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處吸光度，根據(jù)光密度與細(xì)胞干重 (g/L) 的比值為2.50±0.10，確定細(xì)胞干重。

蝦青素HPLC法檢測(cè)：取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min 離心3 min，去離子水洗滌3次，離心獲得菌體。用二甲亞砜 (DMSO) 法破壁，由丙酮抽提至菌體為白色，用容量瓶定容、稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，使用參考文獻(xiàn)[6]的HPLC法，測(cè)定蝦青素含量。

總糖/還原糖檢測(cè)：按照菲林試劑法測(cè)定[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)已報(bào)道的培養(yǎng)基組份優(yōu)化[8-9]和前期本司關(guān)于大宗碳源篩選的試驗(yàn)結(jié)果，為綜合考察多種因素對(duì)法夫酵母XC3015發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的影響，選取酵母抽提物、微量元素 (維生素溶液∶金屬溶液=1∶1)、碳源 (葡萄糖∶麥芽糊精∶糖 蜜=3∶3∶2)、(NH4)2SO4、蛋 白 胨、乳 酸 和KH2PO4這7種主要培養(yǎng)基組份，采用7因素3水平正交表L18(37) 進(jìn)行水平組合處理設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析如表1所示。

由表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所設(shè)定的試驗(yàn)條件下，各因素影響蝦青素產(chǎn)量水平的主次順序?yàn)椋篈>C>E>D>B>G>F，即碳源>酵母抽提物>乳酸>(NH4)2SO4>蛋白胨>KH2PO4>微量元素，蝦青素生產(chǎn)的優(yōu)選發(fā)酵條件為A2B1C2D3E1F3G2，即 (g/L)：碳源 30，蛋白胨 1，酵母抽提物 3，(NH4)2SO47，乳酸 3，微量元素 12.5 mL，KH2PO41.0，最高蝦青素產(chǎn)量為47.5±0.32 μg/mL。

表1 法夫酵母XC3015發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 補(bǔ)料搖瓶補(bǔ)糖工藝優(yōu)化

補(bǔ)料搖瓶補(bǔ)糖工藝優(yōu)化：校正補(bǔ)料泵的補(bǔ)料速率，設(shè)置補(bǔ)料時(shí)間和補(bǔ)料間隔實(shí)現(xiàn)定時(shí)定量補(bǔ)加。補(bǔ)糖1、補(bǔ)糖2、補(bǔ)糖3和補(bǔ)糖4，于24 h開(kāi)始補(bǔ)加40%碳源，補(bǔ)糖間隔分別為4 h、8 h、12 h和16 h，單次補(bǔ)糖濃度(相對(duì)于起始體積，下同)分別為10 g/L、20 g/L、30 g/L和40 g/L，補(bǔ)糖總量(相對(duì)于起始體積，下同)均為360 g/L。補(bǔ)糖5、補(bǔ)糖6、補(bǔ)糖7和補(bǔ)糖8，于24 h開(kāi)始分別補(bǔ)加26.7%、33.3%、46.6%和53.3%碳源，補(bǔ)糖間隔分別為6.0 h、4.8 h、3.4 h和3.0 h，單次補(bǔ)糖濃度均為10 g/L，補(bǔ)糖總量分別為240 g/L、300 g/L、420 g/L和480 g/L。

根據(jù)上述發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果及關(guān)于碳源濃度、補(bǔ)糖控制和法夫酵母克勒勃屈利效應(yīng) (Crabtree effect) 對(duì)法夫酵母蝦青素生產(chǎn)影響的相關(guān)報(bào)道提示，必須對(duì)法夫酵母發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)糖濃度、補(bǔ)糖總量等關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行考察。為此，在更接近于發(fā)酵罐培養(yǎng)模式的補(bǔ)料搖床上設(shè)置初始糖濃均為30 g/L，采用8種不同補(bǔ)糖方式考察碳源補(bǔ)加次數(shù)、補(bǔ)加時(shí)間和補(bǔ)加總量對(duì)法夫酵母產(chǎn)蝦青素的影響，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可知，在補(bǔ)糖總量相同的條件下，補(bǔ)糖間隔越短、單次補(bǔ)糖濃度越低，法夫酵母的菌體濃度和蝦青素產(chǎn)量越高，在單次補(bǔ)糖濃度為10 g/L，補(bǔ)糖總量為360 g/L時(shí)，菌體干重和蝦青素產(chǎn)量分別為72.8±0.7 g/L和233.4±3.1 μg/mL，較單次補(bǔ)糖濃度40 g/L，補(bǔ)糖總量360 g/L時(shí)，分別高30.9%和45.41%。設(shè)定單次補(bǔ)糖濃度為10 g/L時(shí)，隨著補(bǔ)糖總量的增加法夫酵母菌體干重和蝦青素產(chǎn)量提高，但補(bǔ)糖總量超過(guò)420 g/L時(shí)菌體干重和蝦青素產(chǎn)量明顯下降。因此，補(bǔ)料搖瓶中較佳的補(bǔ)糖總量為420 g/L。

圖1 補(bǔ)糖方式和補(bǔ)糖總量對(duì)法夫酵母蝦青素生產(chǎn)的影響

2.3 70 L發(fā)酵罐工藝驗(yàn)證

將三角瓶獲得的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方和補(bǔ)料搖瓶上補(bǔ)糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果在70 L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵工藝驗(yàn)證。比較優(yōu)化前后法夫酵母菌體干重、蝦青素產(chǎn)量、干菌體蝦青素含量等相關(guān)參數(shù)，結(jié)果如表2所示。

表2 70 L發(fā)酵罐法夫酵母發(fā)酵工藝驗(yàn)證

比較法夫酵母70 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝優(yōu)化前后蝦青素生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，優(yōu)化后法夫酵母菌體干重達(dá)到107.7±1.6 g/L，較優(yōu)化前提高15.4%，蝦青素產(chǎn)量達(dá)到515.6±2.4 μg/mL，較優(yōu)化前提高31.9%，干菌體蝦青素含量達(dá)到4.78 mg/g(細(xì)胞干重)，較優(yōu)化前提高14.1%，耗糖總量較優(yōu)化前降低14.3%。

3 結(jié)語(yǔ)

試驗(yàn)考察的7個(gè)影響法夫酵母蝦青素生產(chǎn)的因素按主次順序以及影響由大到小排列為：碳源>酵母抽提物>乳酸>(NH4)2SO4>蛋白胨>KH2PO4>微量元素。在補(bǔ)料搖瓶上優(yōu)化的補(bǔ)糖工藝為單次補(bǔ)糖濃度10 g/L，補(bǔ)糖總量為420 g/L。將上述獲得的發(fā)酵配方和補(bǔ)料工藝在70 L發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證，蝦青素產(chǎn)量達(dá)到515.6±2.4 μg/mL，較優(yōu)化前提高31.9%。