復方牛至油納米乳液制備及其對奶牛乳房炎四種病原菌的體外抗菌試驗

張文娟，朱小甫，尹寶英，熊忙利

（咸陽職業技術學院∕咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室，陜西咸陽 712000）

奶牛乳房炎是奶牛的三大重要疾病之一，全球每年因奶牛乳房炎造成的經濟損失達數十億美元。奶牛乳房炎是由機械性刺激、病原微生物侵襲、化學物理性損傷所引起的炎癥，分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎2 種類型[1］。該病導致奶牛的產奶量急劇下降，甚至失去產奶能力，同時也會造成牛奶質量下降，其發病率為5%～45%。對奶牛乳房炎的治療，國內外主要采用抗生素和化學合成藥物，容易造成藥物在牛奶中殘留[2］，長期使用可引起奶牛乳房菌群產生嚴重的耐藥性以及對公共衛生健康造成危害等后果[3］。納米乳液是將油、水、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例混合而成的新型藥物載體，透明或半透明，低黏度，為動力學和熱力學穩定體系，粒徑在1～100 nm。納米乳液不僅制備簡單，熱力學穩定，還具有增加不溶性藥物的溶解度、提高藥物的生物利用度和提高易水解藥物的穩定性等優點[4］。本研究將中草藥提取物牛至油、丁香酚和化學藥物醋酸氯已定進行復配，制備成復方牛至油納米乳液劑，通過對奶牛乳房炎4 種病原菌進行體外抗菌研究，旨在為臨床提供一種低耐藥性、低殘留、使用方便、安全、高效的新型納米藥物制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌，均由咸陽職業技術學院咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室保存。

1.1.2 培養基 營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、血瓊脂培養基、營養肉湯，均從青島海博生物技術有限公司購買，自制血清肉湯。

1.1.3 試驗藥品 牛至油，濟南凱茵生物科技有限公司生產；丁香酚，南昌貝塔生物科技有限公司；醋酸氯乙定，錦州九泰藥業有限公司生產；蓖麻油聚氧乙烯醚（EL40）、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚（RH40），西安晉湘藥用輔料有限公司生產；吐溫-80、乙醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、蘇丹III 染液、亞甲基藍染液，天津市科密歐化學試劑有限公司生產。

1.1.4 儀器設備 JEM-1230 型透射電子顯微鏡，日本JEOL 公司生產；TGL 16B 型臺式高速離心機，湖南星科科學儀器有限公司生產；ZetasizerNano ZS 型激光粒度測定儀，英國Ma|vern instrument 公司生產；BS-210S 型電子分析天平，德國賽多利斯（sartorius）股份公司生產；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司生產；恒溫培養箱，北京科偉永興儀器有限公司生產；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 復方牛至油納米乳液處方優化 油相選擇，納米乳形成過程中，油應與表面活性劑保持進行互相作用，易于成膜[5］。油相的鏈越短，越易滲透到膜中，而碳氫鏈越長的油相，則會提高藥物的溶解度。將牛至油和丁香酚按照質量比為2∶1 的比例進行混合作為油相。助表面活性劑選擇，助表面活性劑的加入可以調節表面活性劑的親水親油平衡值，降低油水界面張力，提高界面膜的流動性，有利于納米乳的形成[6］。選用無水乙醇、丙二醇、1，3-丁二醇作為助表面活性劑。表面活性劑的篩選及Km 確定，表面活性劑可按親水親油平衡值（HLB）來進行篩選，HLB 在3～8 的乳化劑可制備成油包水型（W∕O）納米乳，HLB在8～16 的乳化劑可制備水包油型（O∕W）納米乳[7］。本試驗待選表面活性劑和HLB 均大于7，分別為EL40、RH40 和吐溫-80。室溫下，將上述3種表面活性劑分別與助表面活性劑按照Km 分別為2∶1、3∶1、4∶1 混勻，再與油相分別按質量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 的比例混勻，攪拌后逐漸滴入蒸餾水，邊加邊攪拌，當水加到一定量時，體系會變黏稠，此時為油包水型，繼續滴加蒸餾水，當體系突然變得不再黏稠時，即由油包水型轉變為了水包油型，此時納米乳液即形成。記錄轉相時添加的蒸餾水量，以表面活性劑、油和水的用量作為相圖的3 個頂點，利用Origin pro 7.5 軟件繪制三元相圖，并根據乳化面積大小確定最佳的表面活性劑。復方牛至油納米乳液制備，稱取6 g 牛至油、3 g 丁香酚，將其置于燒杯中混合攪拌均勻，作為油相；然后稱取27 g 吐溫-80 作為表面活性劑，再稱取9 g 乙醇作為助表面活性劑，將0.25 g 醋酸氯已定加入9 g 乙醇中，攪拌使其溶解，然后將其加入27 g 吐溫-80 中攪拌均勻，制備成混合表面活性劑；然后將油相和混合表面活性劑混合，攪拌均勻，靜置后逐滴緩慢向其中加入蒸餾水54.75 g，邊加邊攪拌，開始時體系黏度較小，隨著水的加入，體系會變黏稠，繼續滴加并不斷攪拌，直至形成復方牛至油納米乳液。采用染色法鑒定復方牛至油納米乳液的結構類型。將亞甲基藍和蘇丹Ⅲ染液分別滴入納米乳液中，觀察2 種染料在納米乳液中的擴散速度，判斷其結構類型[8］。復方牛至油納米乳液形態觀察和粒徑分布，將復方牛至油納米乳液稀釋10 倍，分為2 份。將1 份添加到涂有碳膜的銅網格中，2%磷鎢酸負染30 s，自然蒸發后用透射電鏡觀察了納米乳液的形態。另1 份用激光粒度分析儀測量其平均粒徑和多分散系數。牛至油納米乳的穩定性考察，將復方牛至油納米乳液置于離心管中，10 000 r∕min 離心20 min，觀察其外觀是否清澈透明，有無分層、絮凝、脫色、破乳等現象。將3 批復方牛至油納米乳液密封于玻璃瓶內，置于（4 500±500）lx 條件下，分別于0、5、10 d 觀察其性狀有無變化，并測定乳滴粒徑大小。將3 批牛至油納米乳密封于玻璃瓶內，置于（30±2）℃、相對濕度（65±5）%條件下6 個月，分別于1、2、3、6 月取樣，觀察其性狀有無變化，并測定乳滴粒徑大小。將3批復方牛至油納米乳液密封于玻璃瓶內，置于（25±2）℃、相對濕度（60±10）%條件下12 個月，分別于0、3、6、9 月和12 月取樣，觀察其性狀有無變化，并測定乳滴粒徑大小。

1.2.2 復方牛至油納米乳液的體外抗菌試驗 菌液制備，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌分別挑取2～3 個接種環，接種到營養瓊脂培養基中，并置于37 ℃培養箱中培養24 h。待菌種復壯后，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種至5 mL 營養肉湯培養基中，無乳鏈球菌和停乳鏈球菌分別接種至5 mL 血液瓊脂培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱中進行6 h 的增菌培養。然后采用麥氏比濁法采用滅菌生理鹽水將各試驗菌稀釋到大約0.5麥氏比濁標準（1×108CFU∕mL），置于4 ℃下保存備用[9］。打孔法，在普通營養瓊脂平板上分別薄涂各種菌懸液，后在平板中央打φ 3 mm 圓孔，在孔中加入復方牛至油納米乳液不同濃度稀釋液30 μL，然后將接種平皿均置于37 ℃溫箱中培養，每日觀察記錄結果，觀察7 d。濃度稀釋法，采用試管二倍稀釋法測定復方牛至油納米乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定。

MIC，每株菌株為1 組，共4 組，每組取10 根無菌試管，并進行編號。分別向大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的1 至9 管中各加入2 mL 無菌營養肉湯，向無乳鏈球菌和停乳鏈球菌的1 至9 管中各加入2 mL 血清肉湯。然后分別向每組的第1 管中加入牛至油納米乳液2 mL，混勻后吸取2 mL，加第2 管混勻，依次稀釋到第8 管，從第8 管中取出2 mL 棄去，第9 管肉湯為對照組，第10 管藥液為對照組。分別向1 至9管加入試驗菌液0.1 mL（1×108CFU∕mL），搖勻。然后將各試管置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，通過肉眼觀察無渾濁變化的最高藥物稀釋濃度作為MIC。

MBC，從肉眼未觀察到細菌生長的透明管中取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液0.01 mL 接種到營養瓊脂平板中，提取乳酸鏈球菌和停止乳酸鏈球菌菌液0.01 mL 接種到血瓊脂平板中，置于37 °C 恒溫培養箱中培養24 h。如果培養皿中的菌落數小于3，即可判定為無菌生長。以無細菌生長的最大稀釋藥物濃度作為MBC[10］。

2 結果與分析

2.1 復方牛至油納米乳液的處方優化試驗結果

2.1.1 復方牛至油納米乳液的結構類型 牛至油和丁香酚（質量比2∶1）為油性相，蒸餾水為水相，吐溫-80 與無水乙醇在混合表面活性劑中的質量比為3∶1，復合表面活性劑與油的質量比為4∶1 時，亞甲基藍在納米乳液中的擴散速度明顯快于蘇丹紅Ⅲ，說明所制備的納米乳液為水包油型（O∕W）。

2.1.2 復方牛至油納米乳液的形態及粒徑分布 經過透射電鏡檢測，復方牛至油納米乳液乳滴呈圓球形，乳滴分散性良好，電鏡照片見圖1。Z-Average為33.4 nm，PDI為0.062，其粒徑分布范圍較窄，均為10～100 nm。復方牛至油納米乳液的粒徑分布見圖2（數量分布）和圖3（密度分布）。

圖1 復方牛至油納米乳液的透射電鏡觀測效果

圖2 復方牛至油納米乳液的粒徑分布（數量分布）

圖3 復方牛至油納米乳液的粒徑分布（密度分布）

2.1.3 復方牛至油納米乳液的穩定性

1）外觀。復方牛至油納米乳液為淡黃色澄明液體，外觀清澈透明，無分層、絮凝、脫色、破乳等。

2）高速離心試驗。將復方牛至油納米乳液于10 000 r∕min 離心20 min 后，仍為淡黃色澄清透明的液體，外觀清澈透明，無分層、絮凝、脫色、破乳等現象，表明其穩定性良好。

3）光照試驗結果。經過光照試驗，復方牛至油納米乳液外觀清澈透明，無分層、絮凝、脫色、破乳等現象。其平均粒徑隨時間變化規律見表1，結果表明該制劑對光照穩定。

4）加速試驗結果。經過加速試驗，復方牛至油納米乳液外觀清澈透明，無分層、絮凝、脫色、破乳等現象。其平均粒徑隨時間變化規律見表1，結果表明該制劑在高溫和高濕環境下貯存穩定。

5）長期試驗結果。經過長期試驗，復方牛至油納米乳液外觀清澈透明，無分層、絮凝、脫色、破乳等現象。其平均粒徑隨時間變化規律見表1，結果表明該制劑在長期貯存條件下性質穩定。

表1 復方牛至油納米乳液的穩定性試驗結果

2.2 復方牛至油納米乳液的體外抗菌試驗結果

2.2.1 打孔法 復方牛至油納米乳液體外抗菌效果見表2。由表2 可知，復方牛至油納米乳液對奶牛乳房炎4 種病原菌體外均有抑制作用，其對無乳鏈球菌和停乳鏈球菌抑制作用稍強于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。

表2 復方牛至油納米乳液體外抗菌效果

2.2.2 濃度稀釋法 復方牛至油納米乳液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌及停乳鏈球菌的MIC和MBC見表3。由表3 可知，復方牛至油納米乳液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌的MIC分別為0.375、0.375、0.187、0.187 g∕mL，其MBC分別為0.750、0.750、0.375、0.375 g∕mL。結果表明，牛至油復合納米乳劑對4 種病原菌均有較好的抑制作用，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌和殺菌作用較弱，對無乳鏈球菌和停乳鏈球菌的抑菌和殺菌作用較強。

表3 復方牛至油納米乳液對4 種病原菌的MIC 和MBC

3 小結與討論

本研究采用滴定法建立了牛至油復合納米乳液的偽三元相圖，對牛至油復合納米乳液的配方進行了優化，確定了最佳配方，并對其穩定性進行了測試。觀察結果表明，以吐溫-80 為表面活性劑時，所形成的納米乳液的表面積最大，說明所形成的納米乳液體系更穩定，因此選擇了乳化能力強、高安全性的吐溫-80 作為表面活性劑，無水乙醇作為表面活性劑，牛至油和丁香酚作為油相，蒸餾水作為水相。采用偽三元相圖優化配方。結果表明，當Km為3∶1時，所形成的納米乳液透明、穩定。由于醋酸氯乙酯可以溶解在無水乙醇中，因此將牛至油復合納米乳液溶解在無水乙醇助表面活性劑中，最終制備出復方牛至油納米乳液。用透射電鏡對復方牛至油納米乳液進行檢測，發現液滴呈球形、分布均勻、無黏附、粒徑分布窄。亞甲基藍是水溶性染液，蘇丹紅Ⅲ是油溶性染液，本研究制備的復方牛至油納米乳液，亞甲基藍染液在其中的擴散速度比蘇丹Ⅲ染液快，故判定為水油型（O∕W）納米乳液。試驗結果表明，牛至油復合納米乳液在光照、高速離心、加速、長期試驗過程中均呈現淡黃色透明液體。隨著貯存時間的延長，液滴粒徑略有增大，但變化不明顯，始終在納米乳液的粒徑范圍內，說明該制劑具有良好的貯存穩定性。綜上所述，本研究制備的復方牛至油納米乳液是一種淡黃色透明液體制劑，液滴平均粒徑33.4 nm，該制劑制備工藝簡單、重復性好、性能穩定、質量可控，工業生產方便[10-14］。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌和乳酸鏈球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原微生物。使用抗生素治療奶牛乳腺炎會導致藥物在牛奶中殘留，危及消費者的健康。中藥治療奶牛乳腺炎療效高，復發率低，奶中無藥物殘留，是生產綠色食品的最佳選擇。許多中草藥具有抗菌作用，其中有些甚至優于抗生素。因此，從中藥中尋找替代抗生素的藥物用于治療奶牛乳房炎，不僅可以促進乳品工業的可持續發展，而且可以減少抗生素的殘留，具有很大的潛力，還可維護和提高消費者的生活質量。該研究通過打孔法和試管濃度稀釋法測定了復方牛至油納米乳液對奶牛乳房炎病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌的體外抗菌活性，2種試驗結果基本一致，均表明復方牛至油納米乳液對引起奶牛乳腺炎常見病原菌具有良好的抑菌和殺菌效果。該研究為臨床防治奶牛乳房炎中藥納米制劑的開發提供了理論依據。